Epo及其受体在宫颈癌及癌前病变组织的表达

【摘要】  目的 了解促红细胞生成素（Epo）及其受体(EpoR)在宫颈癌及其癌前病变组织的表达及其意义。方法 用半定量RTPCR法，检测30例宫颈癌组织Epo、EpoR mRNA含量，用免疫组化PV6000方法检测50例宫颈癌及其癌前病变组织Epo、EpoR蛋白表达，并与正常宫颈组织比较。结果 Epo、EpoR mRNA在宫颈癌及正常宫颈组织中均有表达，在宫颈癌组织中的表达水平较高，各组间比较差异有显著性（F=11.83、173.73,q=4.83、10.86,P<0.05）。Epo、EpoR蛋白表达均为阳性，各组间表达率比较，差异有显著性（χ2=5.78、15.88,P<0.05），Epo、EpoR蛋白表达率随宫颈病变程度的加重明显增加；EpoR蛋白表达与Epo蛋白表达呈显著正相关（r=0.57,P<0.01）。结论 Epo/EpoR的表达可能与宫颈癌发生发展有关。

【关键词】  促红细胞生成素 受体 宫颈上皮内瘤样病变 宫颈癌

    ex[x]pressionS OF ERYTHROPOIETIN AND ERYTHROPOIETIN RECEPTOR IN CERVICAL CANCER AND PRECANCEROUS  LESIONWANG CHONGJUAN, CUI ZHUMEI, SUN XIANLU, et al(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao  266003, China) ［ABSTRACT］ob[x]jectiveTo investigate the ex[x]pressions of erythropoietin (Epo) and erythropoietin receptor (EpoR) in cervical cancer and precancerous lesion. MethodsEpo and EpoR mRNA in 30 cases of cervical cancer were determined by semiquantitative RTPCR, and the protein ex[x]pressions of Epo and EpoR in 50 cases of cervical cancer and precancerous lesion were analyzed by immunohistochemistry PV6000.ResultsmRNA ex[x]pressions of Epo and EpoR were found in both cervical cancer and normal cervix，with the ex[x]pressions in cervical cancer significantly higher. The differences in Epo and EpoR mRNA ex[x]pressions among different cervical cancer groups were significant (F=11. 83,173.73;q=4.83,10.86;P<0.05). Positive staining of Epo and EpoR protein was found in all groups, the differences among different groups were significant (χ2=5.78,15.88;P<0.05). The Epo and EpoR increased along with the severity of the lesions. The EpoR ex[x]pression was higher than Epo in the other groups. There was a positive correlation betweem Epo and EpoR (r=0.57,P<0.01). ConclusionEpo and EpoR may play an important role in the development of cervical cancer.

    ［KEY WORDS］erythropoietin； receptor； cervical intraepithelial neoplasia； cervical carcinoma

    近研究发现，促红细胞生成素（Epo）不仅能促进红系祖细胞增生分化，而且还通过结合促红细胞生成素受体（EpoR），激活Epo/EpoR信号转导途径，参与肿瘤细胞抗凋亡、抗低氧及肿瘤新生血管生成。有关Epo/EpoR与肿瘤的关系，在多种肿瘤中已有研究，如肺癌、乳癌、头颈部癌及卵巢癌等。本实验旨在探讨Epo/EpoR在宫颈癌发生发展过程中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  材料来源  新鲜组织标本：包括30例宫颈癌和10例正常宫颈组织。宫颈癌组织取自2005年4月～2006年5月青岛大学医学院附属医院手术病人，年龄28～49岁，平均（39.43±5.75）岁；病理分级：G16例，G216例，G38例；FIGO分期：ⅠB期18例，Ⅱ期12例；病理类型：30例均为鳞状细胞癌。正常宫颈取自因子宫肌瘤行子宫全切的病人，病人年龄45～49岁，平均（47.00±1.25）岁。所有标本均放在-70℃冰箱中保存备用。

    石蜡标本：取自青岛大学医学院附属医院病理科2004～2006年存档蜡块，包括50例宫颈病变及15例正常宫颈，病人年龄27～61岁，平均（41.86±6.97）岁。宫颈病变组织来自活检或手术病人，包括CINⅠ12例，CINⅡ5例，CINⅢ 7例，原位癌14例（9例累及腺体），宫颈癌12例（6例中分化鳞癌，2例伴早期浸润，1例淋巴结转移；2例低分化鳞癌，1例淋巴结转移；2例高分化鳞癌；1例中分化浆液性腺癌；1例宫颈黏液表皮样癌伴有淋巴结转移）。正常宫颈来自子宫肌瘤切除者。所有病理结果均由同一病理医师诊断。

    1.1.2  主要试剂  Trizole液(Sangon公司)，逆转录试剂盒（美国Promega公司）；一抗：兔抗人Epo多克隆抗体（H162:sc7956,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC）、兔抗人EpoR多克隆抗体（H194:sc5624,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC）；PV6000试剂盒（北京中杉公司）。

    1.2  Epo、EpoR mRNA检测

    1.2.1  引物设计与合成  根据Primer 5.0软件设计Epo、EpoR及GAPDH引物，经BLAST分析，确定其特异性。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。 表1  Epo、EpoR、GAPDH引物序列名称引物序列扩增片段Epo上游引物

    1.2.2  RTPCR检测  Trizole液提取总RNA，紫外分光光度计（A260/A280）检测RNA纯度，逆转录反应按操作说明书进行。逆转录合成的cDNA在-20 ℃保存用于PCR。PCR反应条件：Epo 及EpoR均为 94 ℃预变性3 min；94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共40个循环；72 ℃延伸10 min；内参照为GAPDH，94 ℃预变性3 min；94 ℃、30 s,56 ℃、30 s, 72 ℃、1 min,共28个循环；后72 ℃延伸10 min。以去离子水代替cDNA作为空白对照。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，采用自动电泳凝胶成像分析仪及分子分析软件进行图像扫描和分析。用Epo(或EpoR)积分灰度值/GAPDH积分灰度值作为Epo、EpoR mRNA的相对表达含量。

    1.3  Epo、EpoR蛋白检测

    采用免疫组化方法，按照PV6000试剂盒说明书进行操作，一抗工作浓度：Epo为1∶50，EpoR为1∶50，PBS替代一抗作为阴性对照。结果判断：Epo、EpoR阳性染色主要位于细胞膜、细胞质。根据阳性细胞数及染色强度进行评分，阳性细胞数评分：显微镜下（200倍）连续观察5个高倍视野，阴性计为0分，1%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，76%～计为4分；染色强度评分：无色（-）为0分，淡黄色（+）为1分，棕黄色（）为2分，棕褐色（）为3分。阳性细胞数评分与染色强度评分相加，<2分计为“-”，2～3分为“+”，4～5分为“”，6～7分为“”, 6～7分计为“强阳性”。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 11.5软件包处理数据，计量资料比较用单因素方差分析,计数资料比较用χ2检验。

    2  结    果

    2.1  RTPCR检测

    Epo、EpoR mRNA在正常宫颈及宫颈癌组织中均有表达（图1、2），在宫颈癌组织的表达较高，且随宫颈癌分期的升高而增加，差异有显著意义（F=11.83、173.73,q=4.83、10.86,P<0.05）。见表2。相关性分析显示，Epo、EpoR mRNA在各组织中的表达呈正相关（r=0.57,P<0.01）。表2  Epo及EpoR mRNA在各组中的表达比较（

    2.2  免疫组化检测

    Epo蛋白与EpoR蛋白主要表达在细胞膜、细胞质，正常宫颈组织中Epo蛋白表达的阳性率为13.33%，EpoR蛋白表达阳性率为20.00%，在宫颈病变组织中随着宫颈病变程度的加重，Epo蛋白与EpoR蛋白表达强度增加，分布密度增加，差异有显著性（χ2=5.78、15.88,P<0.05）。见表3。表3  不同宫颈组织中Epo与EpoR蛋白的表达

    3  讨    论

    Epo是一种糖蛋白细胞因子，相对分子质量为34 000,与EpoR结合后，形成同源二聚体，再通过JAK/STAT和Ras/MAP激酶等信号转导途径调节红系的增生和分化。EpoR是造血细胞因子受体超家族中的一员，近年来研究发现，EpoR不仅存在于红系干细胞，多种肿瘤细胞中也可表达EpoR，Epo/EpoR的非造血作用已成为研究的热点。YOSHIKO等[1]对24种人类恶性细胞系中Epo/EpoR的作用研究显示，Epo信号转导途径参与肿瘤生长及血管生成，对几乎所有恶性肿瘤的发展都起作用。刘志忠等[2]用免疫组化方法研究Epo在脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤病理分级、Ki67、CD105的关系，发现Epo的表达可作为判断脑胶质瘤恶性程度的一个重要指标，Epo能促进肿瘤细胞增殖和血管形成，从而促进肿瘤生长。类似的研究在头颈部鳞癌[3,4]、肺癌[5]、前列腺癌[6]、卵巢癌[7]等肿瘤中均有报道。提示Epo/EpoR信号途径可能与肿瘤细胞的抗凋亡、抗低氧及侵袭转移有关。

    本实验探讨了Epo、EpoR在宫颈病变中的表达情况，结果显示，Epo、EpoR mRNA在正常宫颈及宫颈癌组织中均有表达，且随着宫颈病变程度的加重，其表达量相应增加，其中，EpoR mRNA增加程度较明显，二者在各组织中的表达呈显著相关性。免疫组化分析显示，Epo蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率较低，仅为13.33%，而在轻中度不典型增生中阳性表达率为58.52%，在重度不典型增生及以上病变中阳性表达率为100.00%；EpoR蛋白的表达趋势与Epo蛋白相一致，但在各组织中的阳性、强阳性表达率比Epo稍高，其原因不清。研究已证实，低氧是Epo产生的主要和直接刺激因子。GEZA等[8]研究表明, EpoR在宫颈不典型增生及宫颈癌组织中表达升高，低氧可进一步诱导EpoR的升高。 本实验中EpoR表达较高，是否与EpoR比Epo对低氧更敏感有关，需进一步研究。

    本文研究结果显示，中、低分化的宫颈鳞状细胞癌中Epo、EpoR的表达比高分化鳞癌高，推测Epo、EpoR的表达与宫颈癌细胞的分化程度有关。免疫组化研究显示，有早期浸润及远处转移病人的Epo、EpoR蛋白表达增加更明显，并且Epo、EpoR蛋白不仅在宫颈癌细胞中高表达，在血管内皮细胞中也有表达，推测Epo、EpoR可能参与了宫颈癌新生血管生成。新生血管生成是宫颈癌生长、转移的必要条件，JAQUET等[9]研究认为，Epo可能是一种新的促血管生长因子，RIBATTI等[10]研究结果表明，EpoR与肿瘤新生血管生成程度有相关性。本实验中有2例特殊类型的宫颈癌（中分化浆液性腺癌和宫颈黏液表皮样癌），其Epo、EpoR蛋白表达比周围正常组织明显增高，提示Epo、EpoR的表达可能与宫颈癌组织来源无明显关系。

    已有研究证实，宫颈癌及人类其他恶性肿瘤中存在Epo及EpoR的高表达，Epo、EpoR在肿瘤中的作用也渐清晰，主要集中在肿瘤细胞抗凋亡、抗低氧及促进肿瘤新生血管生成方面。鉴于Epo、EpoR与肿瘤关系密切，因此，应用重组人促红细胞生成素rhEPO治疗肿瘤相关性贫血应慎重考虑。肿瘤病人贫血发生率较高，大约50%肿瘤病人发生贫血，而在晚期肿瘤或接受化疗或放疗的病人中，贫血的发生率则高达90%。自从rhEPO广泛应用于肾性贫血的治疗以来，rhEPO治疗贫血取得了肯定的疗效。应用rhEPO治疗肿瘤相关性贫血也逐渐增多。但研究发现，rhEPO虽可一定程度改善贫血症状，但不利于肿瘤的控制及预后，可增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性。另有大量研究显示，外源性或内源性Epo均能促进肿瘤的生长。但个别研究发现，Epo治疗贫血不影响肿瘤的生长。陈卫东等[11]研究rhEPO对贫血荷瘤小鼠的放射效应，结果显示rhEPO对贫血荷瘤小鼠的放射有增敏效应。因此，Epo与肿瘤性贫血治疗关系需进一步研究。

    总之，Epo、EpoR在人类多种肿瘤细胞中高表达，且大多数研究表明Epo、EpoR的高表达参与了肿瘤血管生成，促进肿瘤生长、转移，影响肿瘤病人的预后。Epo、EpoR信号转导在多种肿瘤的发生发展过程中起作用，因此阻断该传导途径中的某一环节，可抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤的发生发展。关于Epo、EpoR与肿瘤的关系需要进一步的研究，能否用重组的Epo治疗肿瘤相关性贫血还有待于探索。

【参考文献】
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[2]刘志忠，张宇新，丁秀荣，等. 脑胶质瘤促红细胞生成素的表达及其生物学意义[J]. 实用肿瘤杂志, 2005,20(1):4345.

[3]MOHYELDIN A, LU H, DALGARD C, et al. Erythropoietin signaling promotes invasiveness of human head and neck squamous cell carcinoma[J]. Neoplasia, 2005,7(5):537543.

[4]LAI S Y, CHILDS E E, XI S, et al. Erythropoietinmediated activation of JAKSTAT signaling contributes to cellular invasion in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oncogene, 2005,24(27):44424449.

[5]KOAMI D, EMILIE P, FREDERIC C, et al. ex[x]pression of erythropoietin and erythropoietin receptor in nonsmall cell lung carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2005,11:993999.

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[8]GEZA A, PAUL J, CINDY M, et al. Hypoxiainducible erythropoietin signaling in squamous dysplasia and squamous cell carcinoma of the uterine cervix and its potential role in cervical carcinogenesis and tumor progression[J]. Am J Path, 2003,162:17891806.

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[10]RIBATTI D, MARZULLO A, NICO B, et al. Erythropoietin as an angiogenic factor in gastric carcinoma[J]. Histopathology, 2003,42(3):246250.

[11]陈卫东，张归琦，安永恒. rhEPO结合高低氧对贫血荷瘤小鼠放射增敏的效应[J]. 齐鲁医学杂志， 2002,17(4):286289.