成人牙周炎治疗前后龈沟液蛋白质的电泳分析

作者：李霁　孟焕新　陈智滨　曹采方　 文章来源：中华口腔医学杂志

　　【摘要】　目的　通过分析成人牙周炎患者同一位点基础治疗前后1个月龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中蛋白成分的改变，以期发现能够反映牙周健康及疾病状况的特异蛋白。方法　采用滤纸条法收集12例成人牙周炎患者56个位点GCF样本，以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离，Image MasterTM电泳 图象分析仪分析其中的蛋白质。结果　治疗后蛋白区带数及非血清源低分子量12 000，10 000蛋白的丰度及百分含量较治疗前显著减少(分别为P＜0.001和P＜0.05)，而38 000蛋白百分含量呈增加趋势且与治疗前牙周探诊深度和GCF量呈负相关(P＜0.05)。结论　分子量为12 000，10 000的蛋白与牙周炎症有关；分子量38 000的蛋白与疾病的好转有关。
　　【关键词】　龈沟液　　蛋白质　　电泳　　成人牙周炎

　　龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中的非血清源蛋白与牙周疾病的关系较密切［1，2］，但是关于牙周治疗对GCF中蛋白成分的影响及各蛋白成分与临床指标之间的关系尚未见明确报道。本研究对12例成人牙周炎患者，基础治疗前后GCF中蛋白质成分的变化进行了短期纵向观察，并对其与临床指标间的相互关系和变化规律进行了分析。

材料与方法

　　1.病例选择：按Page和Schroeder［3］所述标准，从北京医科大学口腔医学院牙周科初诊患者中选择12例成人牙周炎(AP)患者(男7名，女5名)，年龄26～60岁(平均49.5岁)。所有受检者均符合以下条件：至少半年未进行牙周治疗或使用抗生素；妇女未妊娠；全身健康，无系统疾病。所取位点为牙周探诊深度(PD)3～9mm、附着丧失(AL)1.5～11.5mm的邻面位点，共计56个，平均4～6个位点/人。
　　2.临床检查项目：菌斑指数(PLI)、出血指数(BI)、牙周探诊深度及附着丧失。所有患者的检查及治疗均由同一人完成。
　　3.GCF的收集：治疗前及经牙周基础治疗(包括口腔卫生宣教、洁治、深刮及根面平整)后1个月，在同一患者的同一位点用2×10mm Whatman 3M滤纸条沟内法重复取30秒GCF样本(若滤纸条带血，则弃之不要，换牙位再取)。所取样本及前臂静脉血血清置于-70℃低温冰箱保存。
　　4.GCF量的测定：分别称出取样前后滤纸条的重量(AE240电子天平，METTLER，Sweden)，二者之差为所收集的GCF量。
　　5.GCF蛋白含量的测定：采用染料结合比色法。滤纸条解冻后，Tris-HCl缓冲液反复2次振荡离心洗提滤纸条上的龈沟液。以小牛血清白蛋白(BSA)为标准，考马斯亮蓝G-250染色，450型微板读数仪(Bio-Rad 595nm)检测，计算出每份样本中的蛋白含量。
　　6.GCF样本的制备和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：电泳前先将GCF洗提液及血清样本干燥后再用2%SDS样本缓冲液溶解，使蛋白浓度达1g/L，加热5分钟(100℃)。采用12.5%丙烯酰胺/双丙烯酰胺均质胶，加样0.3μl，在微量自动快速电泳仪上进行电泳，条件为250V、10.0mA、3.0W、15℃、70avh。同一部位治疗前后的GCF样本及同一患者血清、标准蛋白加样在同一块胶上，标准蛋白的分子量为94 000、67 000、43 000、30 000和17 500。凝胶染色根据周爱民和杨开宇［4］的银染色方法进行改进。
　　7.凝胶分析：用Image MasterTM电泳图像扫描仪测定各样本区带蛋白质亚基的分子量，并对各带进行丰度、百分含量的定量分析。
　　丰度=某分子量蛋白质区带的吸光度值(A)×该区带面积(mm)，反映该分子量蛋白质的含量。
　　百分含量=(某分子量蛋白质的丰度/该泳道所有分子量蛋白质的丰度之和)×，反映某分子量蛋白占该位点GCF中所有蛋白含量的百分比。

结果

　　所有检测位点经牙周基础治疗后，各临床指标的数值明显下降(P＜0.001)，GCF量及其蛋白含量均显著减少(P＜0.001)，蛋白浓度虽然升高，但与治疗前差异无显著性［5］。
　　SDS-PAGE分析显示，同一位点治疗前后GCF的蛋白质区带数、蛋白分子量和各分子量蛋白质的含量(由丰度表示)不完全相同。治疗前蛋白质平均区带数为7.60条(SD=1.69)；治疗后明显减少至6.59条(SD=1.99)，差异有非常显著性(P＜0.001)。

　　治疗前、后各分子量蛋白质的检出率见附图。治疗后既没有原有条带的消失，也无新条带的出现，绝大多数蛋白条带的检出率有所下降，其中非血清源分子量41 000、33 000、18 000、12 000、10 000蛋白治疗前后的检出率差别较大，但无显著意义。

附图　治疗前后不同分子量蛋白质的检出率

　　治疗前、后各分子量蛋白质的丰度及百分含量见表1。无论治疗前或治疗后血清源蛋白(66 000、51 000、26 000)及非血清源低分子量蛋白(12 000、10 000、8 000)的丰度值都较高(均＞0.85)，百分含量均＞10%。同一分子量蛋白在治疗前后的丰度及百分含量不同：绝大多数的蛋白治疗后减少，少数于治疗后增加。治疗后血清源蛋白26 000的丰度及非血清源低分子量蛋白12 000、10 000的丰度及百分含量显著减少(P＜0.05)，而38 000蛋白的百分含量却增加。
　　分析治疗前后各分子量蛋白质的丰度与各临床指标、GCF量及其蛋白含量的关系表明，无论治疗前后26 000丰度均与蛋白含量有极其显著相关(P＜0.001)；而38 000蛋白丰度与治疗前PD、GCF量呈明显负相关(P＜0.05)(表2)。
讨论

　　上述成人牙周炎患者经牙周系统治疗后，牙龈炎症消失或明显减轻，各临床指标比治疗前显著下降，GCF量及其蛋白含量亦明显减少［5］，说明临床治疗效果是成功的。GCF量及蛋白含量能较客观地反映牙龈炎症程度［6］，因此，本研究治疗前后的GCF样本具有客观代表性。
　　本研究显示，各GCF样本蛋白的电泳区带数目、位置和含量因个体及牙位的不同而存在差异，证实了牙周病具有的“部位特异性”特点。治疗后GCF蛋白质的平均区带数比治疗前显著减少(P＜0.001)，说明炎症时龈沟液的蛋白质成分更复杂。比较同一位点治疗前后各蛋白质的检出率可见绝大多数蛋白的检出率在治疗后下降，以非血清源蛋白41 000、33 000、18 000、12 000、10 000较为明显，但未见某些蛋白条带的消失，也无新条带的出现。结果提示，牙周炎患者GCF中的蛋白成分可能与健康人 

表1　比较治疗前后各分子量蛋白质的丰度及百分含量(±s)

　　注：^*：P＜0.1，^**：P＜0.05，^***：P＜0.01；↑：上升趋势，↓：下降趋势

表2　治疗前后各分子量蛋白质丰度与各临床指标、龈沟液量及蛋白含量的相关分析(r)

　注：*：P＜0.1，**：P＜0.05，***：P＜0.001；/：无显著性相关

GCF的蛋白成分没有质的不同，只是与疾病相关的蛋白成分量的增加，与疾病相关的蛋白成分以非血清源蛋白为主。
　　本研究发现26 000蛋白在治疗后丰度值及百分含量均降低，26 000蛋白是免疫球蛋白IgG的轻链，说明基础治疗后IgG含量降低，与Sengupta等［7］报道一致。相关分析表明：无论治疗前后26 000蛋白丰度均与蛋白含量极其显著相关(P＜0.001)。然而相应的IgG重链51 000蛋白在治疗后丰度虽有下降，却无统计学意义，且治疗前后丰度与各临床指标均无明显相关，二者的不一致性可能与26 000不仅是IgG的轻链，同时也是IgA、IgM的轻链有关。

　　本研究发现12 000和10 000低分子量蛋白的丰度及百分含量在治疗后显著减少(P＜0.05)，这与Makela等［2］报道的对治疗反应好的位点12 000蛋白水平的显著下降相一致。以上结果提示12 000、10 000蛋白可能与牙周疾病有关。关于这两种低分子蛋白的来源报道不多，Curtis等［8］认为低分子量蛋白可能是结缔组织或血清蛋白降解产物，Makela等［2］提出12 000蛋白与宿主来源的中性蛋白酶溶解活性有关，对他们的认识有待进一步研究。
　　本研究的另一重要发现是分子量为38 000的蛋白在治疗后丰度及百分含量均升高，高丰度蛋白检出率增加。相关分析表明，38 000蛋白丰度在治疗前与PD、GCF量呈负相关，说明牙周袋越浅，龈沟液量越少，38 000蛋白含量越高，38 000的蛋白可能与疾病好转有关。本研究发现38　000蛋白在血清样本电泳谱图中偶见，故认为它可能部分来源于血清或与之有关。鉴于38 000蛋白质在治疗后增加，有必要对其来源进行深入研究。
　　志谢　本研究电泳分析部分曾得到北京医科大学基础医学院免疫实验室马大龙教授，袁勇博士的大力协助
作者单位：100081北京医科大学口腔医学院（李霁现在北京医科大学附属医院口腔科100034）

参考文献

　1　Curtis MA, Sterne JAC, Price SJ, et al. The Protein composition of crevicular fluid sampled from male adolescents with no destructive periodontitis: ba[x]seline date of a longitudinal study. J Periodont Res, 1990, 25:6-16.
　2　Makela M, Sorderling E, Paunion K, et al. Protein composition of crevicular fluid before and after treatment. Scand J Dent Res, 1991, 99:413-423.
　3　Page RC, Schroeder HE. Features in man and animals. In: Periodontitis in man and other animals. Zurick: Karger, 1982. 223.
　4　周爱民，杨开宇.凝胶电泳中微量蛋白质的检测技术(酶学研究技术).第1版.上海：上海科学出版社，1987.100.
　5　李霁，孟焕新，陈智滨.成人牙周炎基础治疗前后临床指标龈沟液量及其蛋白含量的变化及相互关系.现代口腔医学杂志，1997，11(专辑)：27-32.
　6　Biswas SD, Duperon DF, Chebib FS. Study of crevicular fluid in relation to periodontal disease in children: Effect of age, sex and gingival inflammation on crevice fluid volume, pocket depth, pH of supragingival plaque and crevice, collagenase activity and urea. J Periodont Res, 1977, 12:250-264.
　7　Sengupta S, Lamster IB, Khoct A, et al. The effect of treatment on IgG, IgA, IgM and α-2-macroglobulin in gingival crevicular fluid from patients with chronic adult periodontitis. Arch Oral Biol, 1988, 33:425-431.
　8　Curtis MA, Gillet IR, Griffiths GS, et al. Detection of high-risk groups and individuals for periodontal disease: laboratory markers from analysis of gingival crevicular fluid. J Clin Periodontol, 1989, 16:1-11.