冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究

作者：赵智刚,唐晓琼,黎纬明,游泳,邹萍　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科，武汉 430022

　　【摘要】为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物学特性和支持造血能力的影响，采用常规方法分离培养骨髓MSC，将传代后的细胞用含10%二甲亚砜、40%胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中，观察短期(4周)和中期(9-15月)复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同冻存前的MSC进行比较。 结果表明：中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)%和(93士2.51)%;冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落(CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM)的生长作用和冻存前MSC相似。结论：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，细胞活性略有下降，但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。

　　【关键词】 支持造血

　　Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)% and (90士3.75)% for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.

　　Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell; hematopoiesis support

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有多向分化和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果[1-4]。将培养后的MSC冻存，在患者需要MSC治疗时给予输注，具有很好的临床应用前景。但是，冻存是否会影响MSC的生物学特征，我们尚不清楚。因此，本研究将骨髓来源的MSC冻存于-196℃液氮中，观察中期和短期冻存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同冻存前的MSC进行比较，为进一步在临床中的应用提供详尽的实验依据。

　　材料和方法

　　试剂

　　IMDM、DMEM、DF12、MCDB培养液、胎牛血清、马血清和甲基纤维素均为Gibco公司产品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗体购自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3购自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式维甲酸、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)和二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司。

　　MSC的分离和培养

　　骨髓来自8例健康志愿者(年龄18-34岁，平均29岁)。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴细胞分离液(密度1.077)400×g 离心20分钟，取白环以上细胞部分，计数后接种于含40% MCDB、2% FCS的DF12培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到70%融合时，常规消化传代。

　　MSC的冻存和复苏

　　将1×106细胞加入含10% DMSO和40% FCS的IMDM中，总体积1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天转入-196℃中冻存。将中期9-15个月(平均13个月)和短期(4周)冻存的MSC置于37℃水浴中快速复温，冻融后加入8 ml IMDM混匀后离心，然后再用IMDM洗涤1次，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。第2天，更换新鲜培养液。

　　细胞活性和增殖能力测定

　　应用台盼蓝拒染回收率(TBR)试验检测复苏细胞的活性，TBR(%)=冻存后活细胞计数/冻存前活细胞计数×台盼蓝拒染率×。将冻存前后的MSC接种在24孔板中(5×103细胞/孔)，置37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔1天取2孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。

　　细胞免疫表型分析

　　用含20 g/L BSA的PBS将胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的细胞悬液。每个上机试管中加入500 μl细胞悬液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR单克隆抗体，同时设空白对照，于4℃孵育30分钟，PBS洗3遍。再加入FITC标记的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分钟，PBS洗4遍，用流式细胞仪检测。使用cellquest软件获取并分析数据。

　　体外诱导多向分化检测

　　成骨诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，3周后应用von Kossa染色检测钙化小结。

　　脂肪诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，7天后油红O染色检测脂肪滴。

　　支持造血的能力测定

　　将冻存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ线照射，然后更换为长期培养液(含12.5% FCS、 12.5%马血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氢化考的松的IMDM)。获取健康人骨髓单个核细胞，预先培养4小时以去除贴壁细胞，将悬浮细胞按照1×106/ml接种在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2条件下培养，每周半量换液。4周后获取全部细胞接种于甲基纤维素体系中测定其集落形成能力。培养体系为: IMDM中含30%马血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巯基乙醇、1%甲基纤维素和重组细胞因子。细胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成实验在24孔培养板中进行，于37℃、5% CO2条件下培养14天。每孔接种1×106个细胞。14天后在倒置显微镜下计数集落，50个以上细胞为1个集落。

　　统计学分析

　　采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验数据用平均值±标准误表示，组间比较应用方差分析。

　　结 果

　　骨髓MSC的形态特征和生长特点

　　于倒置显微镜下，冻存前骨髓MSC为成纤维样，胞浆丰富，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。根据细胞生长曲线，骨髓MSC的倍增时间约为42.03士2.41小时。细胞形态和倍增时间随着细胞传代并不发生改变。

　　冻存后MSC的活性率和增殖能力

　　骨髓MSC的活性率(TBR)随着冻存时间的延长略有下降。短期冻存MSC的TBR为93士2.51%;中期冻存MSC的TBR为90士3.75%。二者之间并没有显著性差异。冻存后MSC的增殖能力同冻存前相比较，没有明显差异。依据生长曲线可以得出短期和中期冻存后骨髓MSC的倍增时间分别为39.54士3.53小时和41.64士1.68小时。

　　冻存前后MSC的免疫表型

　　通过流式细胞仪检测冻存前后骨髓MSC的免疫表型发现，冻存前后MSC均表达CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性(表1)。CD分子的表达量在冻存前后略有不同，但均不存在显著性差异。

　　多系分化的鉴定

　　成骨分化 2周后细胞聚集成集落，并有少量钙盐沉积，继续培养1周，细胞呈现多层生长的结节状，并有大量钙盐沉积，而对照组细胞仍为单层生长，无钙盐沉积。von Kossa 染色证实为钙盐沉积(图A)，对照组无上述现象出现。

　　成脂肪分化 3-5天后发现少量细胞中有小脂肪滴出现，继续诱导，1周后可以看见大部分细胞胞体变大，胞浆出现大量脂肪滴，油红O染色证实为脂肪滴(图B)，而对照组细胞胞浆中无脂肪滴出现，油红O染色为阴性。

　　冻存后的MSC同样具有成骨和成脂肪分化能力。

　　支持造血作用

　　为了评估冻存是否影响MSC支持造血的能力，将骨髓单个核细胞接种于照射过的冻存前和复苏的MSC中，在长期骨髓培养液中培养4周后检测CFU生成情况。如表2所示，冻存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的产率在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC为滋养层的骨髓长期培养体系中并无显著性差异。

　　讨 论

　　MSC是造血微环境中主要组成部分，通过合成、分泌多种造血因子和黏附分子来调控造血干细胞的增殖、分化和自我更新。既往研究显示，MSC可以合成并分泌多种造血细胞生长因子，具有维持长期培养起始细胞(LTC-IC)的能力，促进造血干细胞的增殖和分化[5]。联合MSC的移植方案还可以促进HSC的植入和移植后的造血恢复[6]。但是，在体外培养扩增中，MSC的增殖能力会逐渐下降并发生分化，支持造血的能力减弱。将扩增后或者增殖旺盛的MSC进行冻存，在需要的时候复苏培养，可以有效地解放上述问题并确保提供足够的MSC应用于临床。

　　既往的大量研究显示，造血干细胞可以在液氮中长期冻存，复苏后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC经过低温冻存和复苏，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影响，尚不明确。因此，我们观察了骨髓MSC经过短期(4周)和中期(9-15月)冻存后的生物学特性和支持造血能力。结果显示，经过中期和短期冻存后MSC的形态并未发生改变，仍为梭形，贴附在培养瓶底。冻存后MSC的活性略有下降，但冻存并不影响细胞的增殖能力，冻存前和中期、短期冻存后MSC的倍增时间在40小时左右，经统计学分析不具有显著性差异。通过FACS检测，冻存前后的MSC的免疫表型没有明显改变，表现为CD29、CD44和CD105为阳性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR为阴性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我们将经过中期和短期冻存后MSC诱导向脂肪和骨分化，结果显示冻存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且这种分化能力，并不随着复苏后细胞的传代而发生变化。由此可见，中期和短期冻存并不影响MSC的生物学特性。

　　支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，冻存后MSC支持造血能力是否发生变化将直接影响MSC的临床应用。Majumdar等[7]的研究显示，骨髓MSC可以分泌多种造血生长因子，具有支持造血作用，能促进骨髓来源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是冻存后MSC支持造血能力如何变化，既往并无报道。在本实验中，我们通过检测体外长期培养体系中集落形成情况来评估冻存后MSC对造血干细胞的支持作用。骨髓单个核细胞在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC作为滋养层的骨髓长期培养体系中培养，4周后的骨髓单个核细胞的CFU生成率在各体系之间没有显著性差别。这说明经过中期和短期冻存后MSC仍具有支持造血能力，同冻存前比较，支持造血能力没有明显变化。进一步分析上述不同培养体系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情况，结果表明：冻存前后MSC均可以促进CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促进定向祖细胞的增殖能力在冻存前后没有明显差别。这些结果表明，冻存并不影响MSC促进不同阶段造血祖细胞增殖、分化的能力。

　　综上所述，本研究通过体外实验初步证实：经过中期和短期低温冻存的骨髓MSC并不改变其固有的生物学特性。虽然冻存可以导致部分细胞损伤，但是并不影响剩余细胞的增殖能力和多向分化能力。此外，冻存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，冻存后MSC是否在体内仍具有上述生物学性状和支持造血功能，尚需进一步研究证实。

　　【参考文献】

　　1Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418(6893): 41-49

　　2Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-377

　　3Noort WA，Kruisselbrink AB，in’t-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-878

　　4Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol，2000; 18: 307-316

　　5Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol，1998; 176:57-66

　　6Koc ON，Lazarus HM.Mesenchymal stem cells: heading into the clinic.Bone Marrow Transplant，2001; 27: 235-239

　　7Majumdar MK，Thiede MA，Haynesworth SE，et al. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages.J Hematother Stem Cell Res，2000; 9: 841-848