两步法扩增诱导脐血及动员外周血CD34+细胞来源树突状细胞的比较

　    作者：王亚非 孟恒星 葛薇 于珍 李云涛 李桥川 万长春 徐燕 李新 李增军 王国蓉 尤胜国 邱录贵 作者单位：中国医学科学院、中国协和医科大学、 血液学研究所和血液病医院、 实验血液学国家重点实验室，天津 300020

　　【摘要】 　　为了比较先扩增、后诱导的两步法从脐血(CB)CD34+细胞和动员外周血(MPB)CD34+细胞诱导所得DC的产量及功能，将免疫磁珠分选获得的CB-CD34+细胞和MPB-CD34+细胞用FL、TPO、SCF、GM-CSF等细胞因子先扩增10天，然后加入GM-CSF、IL-4及TNF-α、CD40Ab、PGE2等细胞因子组合诱导获得DC。采用流式细胞仪检测DC表型，混合淋巴细胞培养检测DC刺激异基因T细胞增殖能力，ELISA法检测DC分泌IL-12能力，Transwell板检测DC在次级淋巴组织趋化因子(SLC)介导下的趋化功能。结果表明： ① 扩增10天时CB组、MPB组细胞中CD14+CD1a-细胞含量无显著差异[(40.48±16.85)% vs (28.07±23.19)%， P>0.05]。但由于CB组细胞扩增倍数显著高于MPB组(388.88±84.63倍vs 79.67±10.32倍， P<0.01)，CB组CD14+CD1a-细胞扩增倍数显著高于MPB组(189.42±25.02倍vs 28.74±23.27倍， P<0.01); ②TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下与TNF-α条件下相比，CB组和MPB组所得DC均表达更高的CD83[分别为(34.52±11.22)% vs (3.70±2.27)%、(36.69±13.36)% vs (7.34±3.364)%， P均<0.01]; ③CB组与MPB组在TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导条件下所得DC均高水平表达CD83、CD86、HLA-DR、CD11c、CD54、CD40，CB组所得CD83+细胞的扩增倍数显著高于MPB组(198.72±117.53倍vs 33.95±6.19倍，P<0.01); ④CD40Ab/PGE2/TNF-α条件下CB与MPB来源的DC在刺激异基因T细胞增殖、IL-12的分泌[(16.2±4.31)pg/ml vs (13.5±4.1)pg/ml]以及SLC介导的迁移率[(28.09±7.76)% vs (18.5±3.47)%]上均无显著差别(P均>0.05)。结论： 在两步法培养体系下，CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞来源的DC具有相同的功能，而前者产量显著高于后者。

　　【关键词】 树突状细胞,脐血,动员外周血,CD34+细胞 两步法培养法

　　AbstractTo compare the expansion efficiency and function of dendritic cells derived from CB-CD34+ cells and MPB-CD34+ cells by using two-step culture method， enriched CB-CD34+ cells or MPB-CD34+ cells with immunoadsorption were primarily cultured in the presence of FL, SCF, TPO， GM-CSF for 10 days, and then further cultured with a combination of GM-CSF,IL-4,TNF-α,CD40Ab and PGE2 to induce DC. The DC phenotypes were detected by flow cytometry, the expansion efficiency and cell function were evaluated by mix-lymphocyte reaction(MLR), IL-12 level was detected by using ELISA and the chemotactic function mediated by secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) was determined with Transwell plate. The results indicated that after 10 days of expansion, there were no significant difference in the percentage of CD14+CD1a- cells between CB and MPB [(40.48±16.85)% vs (28.07±23.19)%， P>0.05], but the expansion of total cells in CB was higher than that in MPB (388.88±84.63-fold vs 79.67±10.32-fold， P<0.01), so the yield of CD14+CD1a- cells from CB was significantly higher than that from MPB too (189.42±25.02-fold vs 28.74±23.27-fold， P<0.01). The percentage of CD83+ DCs cultured with CD40Ab/PGE2 derived

　　from CB were higher than those cultured with TNF-α derived from MPB respectively [(34.52±11.22)% vs (3.70±2.27)% and (36.69±13.36)% vs (7.34±3.364) % respectively, P<0.01]. In the same circumstance, the yield of CD83+ DCs derived from CB was much more than that from MPB (198.72±117.53 times vs 33.95±6.19 times， P<0.01) . There were no difference in stimulating capacity, IL-12 secretion and migration capacity between DCs derived from CB and MPB. It is concluded that DCs induced from CB-CD34+ cells by two-step culture possesse similar functions with that from MPB-CD34+ cells, but the yield of DCs from CB CD34+ cells is much more than that from MPB CD34+ cells.

　　Key wordsdendritic cell; cord blood; mobilized peripheral blood; CD34+ cell; two-step culture method

　　采用先扩增后诱导的两步法从CD34+细胞诱导获得树突状细胞(dendritic cell， DC)可以在保证DC功能的基础上显著提高DC产量[1]。脐血(cord blood， CB)与骨髓(BM)、动员的外周血(mobilized peripheral blood, MPB)相比，其CD34+细胞含量更高、增殖潜能更大，因此更适于两步法大量诱导DC。但有文献报道，CB单核细胞(Mo)来源的DC(CBMo-DC)与成人外周血(APB)Mo来源DC(APBMo-DC)相比，具有产量低、抗原捕获能力弱及刺激异基因T细胞增殖能力低下等缺点[2]。而两步法中第二步的诱导实际上是从CD14+CD1a-细胞开始的[1]，类似于从Mo诱导DC的体系。因此，两步法从CB-CD34+细胞诱导所得DC是否也存在功能缺陷，有关研究目前国内外均未见报道。为此，设计了本研究，以比较在我们所建立的体系中CB-CD34+细胞及MPB-CD34+细胞来源DC的产量及功能，从而评价两步法从CB-CD34+细胞诱导获得DC的可行性。

　　材料和方法

　　材料

　　CD34+细胞及CD3+细胞免疫磁珠分选试剂盒购自Miltenyi Biotec 公司; SCF、TNF-α、TPO及次级淋巴组织趋化因子(SLC)购自Peprotech公司; IL-3、前列腺素E2(PGE2)、IMDM、四甲基偶氮唑盐(MTT) 购自Sigma公司; FL由Immunex公司惠赠，活化型CD40Ab由苏州大学医学院免疫学研究所张学光教授惠赠; GM-CSF购自Schering-Plough公司; IL-4购自Stemcell Techniologies公司; FITC标记鼠抗人CD1a、CD83、CD86、CD40、CD3、HLA-DR、CD34单克隆抗体购自Becton Dickinson公司;淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077) 购自TBD生物工程有限公司; 60 g/L羟乙基淀粉购自Braun Medical公司;胎牛血清(FCS) 购自Gibco公司; IL-12 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;Transwell板(8 μm)购自Corning公司。

　　CD34+细胞的分离纯化与扩增

　　在无菌条件下取足月顺产胎儿CB,用60 g/L 羟乙基淀粉沉淀红细胞后Ficoll液分离获得单个核细胞(MNC)，对于MPB则直接用Ficoll液分离获得MNC，将MNC与CD34+细胞免疫磁珠孵育30分钟,让细胞通过置于磁场中的分离柱后加压洗脱,获得CD34+细胞。将2.0×104/ml CD34+细胞接种于含10% FCS的IMDM，加入FL 100 ng/ml、TPO 100 ng/ml、SCF 50 ng/ml及GM-CSF 100 ng/ml。培养第4天加入等体积新鲜培养液(含相同浓度的FL、TPO、GM-CSF，半量浓度的SCF)。培养第7天、第10天维持细胞浓度为2.0×105/ml左右，并添加与第4天相同浓度细胞因子的新鲜培养液。培养第10天收集细胞进行计数、表型检测并开始诱导。

　　DC的诱导

　　将扩增10天的细胞用含GM-CSF 100 ng/ml、IL-4 20 ng/ml的完全IMDM调整细胞密度为5×105/ml,并接种于25 cm2培养瓶中，每3天半量换液并补充GM-CSF、IL-4，第6天换液时加入40 ng/ml的TNF-α、40 U/ml的CD40Ab、10-7mol/L的PGE2等细胞因子(组合)，第8天收获细胞。

　　T细胞的获得

　　无菌条件下用肝素抗凝管采集健康成人外周血10 ml， Ficoll液分离的MNC 与CD3+细胞免疫磁珠孵育30分钟,让细胞通过置于磁场中的分离柱后加压洗脱,获得CD3+细胞。

　　细胞表型的流式细胞仪检测

　　取1×106个细胞加入20 μl 荧光素标记抗体,4℃下孵育30分钟后洗涤2遍,以流式细胞仪检测表型。

　　混合淋巴细胞反应(MLR)

　　取96 孔U 型培养板,每孔加诱导后的细胞1 ×103、 0.5×103、 0.25×103、 0.125×103个(每组设3个复孔) , 137Cs照射灭活(3 000 cGy) 后作为刺激细胞。每孔中加入T细胞1×104个作为反应细胞。共培养5天。培养结束前4小时每孔加入新鲜配制的5 mg/ml MTT 20μl, 反应结束时离心弃上清,每孔加入二甲亚砜100 μl, 振荡混匀后用酶标仪检测570 nm波长处A值,并按下述公式计算刺激指数( SI) :刺激指数( SI) =A实验组/A对照组

　　DC 分泌IL-12 的检测

　　将诱导后的细胞180×g离心5分钟，收集上清，按ELISA试剂盒说明书检测IL-12(p70)含量。

　　趋化试验

　　参照文献[4]进行，用趋化缓冲液(含0.5% BSA的IMDM)调DC浓度为2×106/ml， Transwell板的上层添加DC悬液50 μl,下层添加含有或不含有次级淋巴组织趋向因子(secondary lymphoid tissue chemokine, SLC)(100 ng/ml)的缓冲液500 μl， CO2孵箱孵育4小时，收集Transwell板下层的细胞， 400×g离心5分钟，弃上清，PBS定容至50 μl，显微镜下计数细胞。迁移率(%)=(下层细胞数/添加的细胞数)×。SLC条件下的迁移率减去不含SLC条件下的迁移率(自发迁移率)，即为SLC介导的迁移率。

　　统计学处理

　　采用单因素方差分析及t 检验, P<0. 05时差异具有显著性。

　　结果

　　CD34+细胞扩增效率

　　CB-CD34+细胞的7天、10天的扩增倍数分别为113.00±33.22和388.88±84.63。而相同条件下MPB-CD34+细胞的扩增倍数分别为32.75±6.18、79.67±10.32。不管是扩增7天还是10天，CB-CD34+的扩增效率显著高于MPB-CD34+细胞(P<0.01)。

　　DC前体细胞产量

　　CB-CD34+细胞经过7天、10天的扩增后CD14+CD1a-细胞含量分别为(40.48±16.85)%、(44.39±12.35)%。而MPB组 CD14+CD1a-细胞含量分别为(28.71±12.45)%、(28.07±23.19)%，不同扩增时间点上两种来源的CD14+CD1a-细胞含量无明显差异(P均>0.05)。结合细胞扩增倍数，扩增7天、10天时，CB组CD14+CD1a-细胞的扩增倍数为51.77±17.74、189.42±25.02，而MPB组则分别为9.15±3.37、28.74±23.27，显著低于CB组(P均<0.01)。

　　DC产量

　　CB组及MPB组扩增后的细胞在TNF-α/CD40Ab/PGE2条件诱导下所得CD83+细胞扩增倍数在CB、MPB分别为198.72±117.53及33.95±6.19，前者显著高于后者(P<0.01)。

　　DC表型

　　如表1所示，TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导方案与TNF-α相比，CB组及MPB组所得DC在CD83、CD86的表达明显提高(P<0.05)，而CD1a、HLA-DR与CD54的表达无显著差异(P>0.05)。在TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导条件下，CB与MPB来源的DC在多数表型上无明显差异。Table 1. Phenotypes of DCs derived from cord blood and mobilized peripheral blood (略)

　　DC功能检测

　　刺激异基因T细胞增殖能力如表2所示，CB与MPB来源DC在刺激异基因T细胞增殖能力上无明显区别(P>0.05)。

　　TNF-α/CD40Ab /PGE2条件下CB与MPB来源DC的IL-12分泌能力分别为： 13.5±4.1 pg/ml、16.2±4.31 pg/ml，二者间无明显区别(P>0.05)。迁移实验表明： CB组所得DC在TNF-α/CD40Ab/PGE2及TNF-α条件下的SLC介导的迁移率分别为(4.59±0.68)%、 (18.5±3.47)%;而MPB组所得DC在相同条件下的SLC介导迁移率分别为(2.70±0.72)%、(28.09±7.76)%。不论是CB组还是MPB组，TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下所得DC的SLC介导的迁移率均显著高于TNF-α条件下所得DC(P均<0.01)。TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下，CB组与MPB组所得DC的SLC介导的迁移率相近(P>0.05)(表3)。Table 2. Ability of DCs to stimulate the allogenic T lymphocytes into proliferation (略)Table 3. Migration rate of DCs derived from cord blood and mobilized peripheral blood (略)

　　讨论

　　Arrighi等[1]在研究DC的分化途径时发现，CD34+细胞经过早期细胞因子的扩增可以大量获得CD14+CD1a-的DC前体细胞，该细胞可以在GM-CSF/IL4/TNF-α条件下进一步诱导获得DC。两步法将干细胞的扩增与DC的诱导相结合，显著提高DC的产量。我们也利用这一方法成功从CB-CD34+细胞获得大量DC[3]。但考虑到两步法中的第二步类似于Mo培养体系，而CB-Mo来源DC在功能上存在一定缺陷[2]，因此有必要进一步评价上述方法所得DC的功能以衡量两步法从CB诱导DC的可行性。已有文献报道MPB-CD34+细胞与APBMo来源DC具有相同的功能[4]，因此，我们比较相同条件下CB-CD34+细胞和MPBCD34+细胞来源DC的产量及功能。 我们发现，在扩增阶段CB-CD34+细胞在FL/TPO/SCF/GM-CSF等细胞因子的作用下，细胞总数在第7天和第10天的扩增倍数分别为113±33.22和388.88±84.63，均显著高于相同条件下MPB-CD34+细胞的扩增倍数(分别为32.75±6.18和79.67±10.32， P均<0.05)。扩增后的细胞中CD14+CD1a-细胞所占比例二者相近，但由于扩增效率相差较大，不论第7天还是第10天CB组的DC前体细胞产量显著高于MPB组(分别是51.77±17.74倍 vs 9.15±3.37倍、189.42±25.02倍 vs 28.74±23.27倍，P<0.05)。出于同样的原因，TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下，尽管CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞所得DC在CD83表达上无显著差异，但在CD83+细胞的产量上CB组显著高于MPB组(198.72±117.53 vs 33.95±6.19，P<0.01)。以上结果提示，由于CB-CD34+细胞具有更高的扩增能力，我们所建立的扩增体系更有利于从CB-CD34+细胞诱导获得CD83+DC。不成熟的DC高水平表达CD1a，而成熟后的DC上CD83表达水平显著提高，因此CD83的高低代表着DC的成熟程度。我们的研究以及文献报道都提示两步法诱导DC时，TNF-α促成熟条件下所得DC的CD83表达不充分[3，5]。这与TNF-α条件下从Mo诱导DC时情况相似。已有文献报道，CD40Ab和PGE2可以不同程度地提高APBMo-DC的成熟程度和趋化功能[6，7]。我们的研究也发现不管是CB组还是MPB组，TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导方案与TNF-α相比，所得DC在CD83、CD86的表达均得到明显提高(P<0.05)，而两组间在CD83、CD86、HLA-DR及CD54等的表达上无显著差异。这提示TNF-α/CD40Ab/PGE2可以显著提高两步法所得DC的成熟程度。DC捕获抗原后，在局部淋巴结分泌的次级淋巴组织趋化因子(SLC)的趋化下迁移到引流淋巴结，在此向T细胞呈递抗原并通过直接接触及分泌的IL-12介导Th0向Th1方向分化并进而介导T细胞分化为CTL。因此，IL-12的分泌能力以及SLC介导下的趋化能力对于DC发挥其免疫学功能具有重要意义。我们研究发现，TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下MPB与CB来源的DC在刺激异基因T细胞增殖能力及IL-12的分泌上均无显著差异。在迁移功能上，TNF-α条件下所得的DC，无论是CB来源还是MPB来源均不能在SLC介导下有效地迁移。而在TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下，CB组及MPB组所得DC的SLC介导的迁移率均显著提高(P均<0.01)，而两组间的迁移能力无显著差异(P>0.05)。总之，在我们所建立的培养体系下，由于扩增能力上的优势，CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞相比，无论是DC前体细胞还是CD83+DC细胞产量均明显高于后者。TNF-α/CD40Ab/PGE2与 TNF-α相比可以显著提高两步法所得DC的成熟程度及SLC介导下的迁移能力。在TNF-α/CD40Ab/PGE2促成熟条件下CB-CD34+细胞来源DC与MPB-CD34+细胞来源DC在表型、刺激异基因T细胞增殖、IL-12分泌以及SLC介导的迁移能力上无明显差别。这一研究成果将对从CB大量获得具有完整功能的成熟DC提供实验依据。

　　致谢： 感谢苏州大学医学院生物技术研究所张学光教授惠赠CD40Ab，特此鸣谢。