MAL基因在原发食管癌组织表达及临床意义

 
　　作者：陈皓　　作者单位：泰安市中心医院肿瘤外科，山东 泰安 271000


　　THE ex[x]pression AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MAL GENE IN PRIMARY ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO (Department of Oncology, Taian Central Hospital, Taian 271000, China)

　　[ABSTRACT] ob[x]jective To explore the relevance between MAL gene ex[x]pression, clinical stage and histologic grade of esophagus cancer. Methods The MAL gene ex[x]pression in 45 cancer patients was detected with RT-PCR and semi-quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA ex[x]pression of MAL in 40 cancer tissue samples was lower than that in the surrounding esophagus mucous membrane (χ2=30.59,P<0.01). The gene ex[x]pression in stages Ⅰ and Ⅱ patients was higher than that in stage Ⅲ patients (t=5.952,P<0.001). Those with lymph node me[x]tastasis showed lower gene ex[x]pression than patients without (t=6.743,P<0.001). Conclusion In esophagus cancer, the MAL gene ex[x]pression was associated with histologic grade and clinical stage, which can be used for determining tumor malignancy and predicting its prognosis.

　　[KEY WORDS] Esophageal neoplasms; MAL gene; Reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction

　　MAL基因是由ALONSO等[1]于1987年分离得到的抑制肿瘤生长的新基因，MAL基因失活及异常与细胞信号转导、肿瘤的发生发展和临床预后等有一定关系。近年来，MAL基因与食管癌的关系已成为研究的热点。本研究利用定性和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测食管癌组织及其癌旁组织中MAL基因的表达情况，旨在探讨MAL基因在食管癌发生发展过程中的作用，及其与临床病理因素的关系，为食管癌发病机制的研究提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　1.1.1 病例选择 2004年6月~2006年3月，泰安市中心医院住院的食管癌病人45例，男25例，女20例;年龄36～79岁，平均57.5岁。术前均未发现远处转移，未行放、化疗治疗。手术方式均为经左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合术，术中无肉眼可见肿瘤残留。术后病理检查均证实为鳞癌。按UICC食管癌分期标准(1997)进行分期。

　　1.1.2 标本取材和保存 食管癌组织及癌旁组织取自食管癌病人手术标本，组织离体后立即无菌取材，从肿瘤生长活跃无坏死的部位取下约1 cm3癌组织及5 cm外癌旁组织，标本30 min内送实验室，新鲜提取总RNA;不能保证30 min内制备样品的，在取材后放-80 ℃冰箱保存备测。

　　1.2 检测方法

　　采用半定量RT-PCR法检测MAL mRNA的相对表达水平。①总RNA提取：采用Trizol提取总RNA，并进行纯度和浓度测定。②RT反应:于DEPC处理的Eppendorf管中，加入1 μg总RNA、MMLV及随机引物等，快速离心混匀后，37 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min灭活MMLV，快速离心使蒸气沉于管底。③PCR反应：于0.5 mL Eppendorf管中加入RT反应产物、PCR反应体系、MAL上游引物(5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′)、MAL下游引物(5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′)、β-actin上游引物(5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′)，以及β-actin下游引物(5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′)，扩增片段长度为500 bp;95 ℃ 5 min，离心使蒸气沉于管底，加Taq DNA聚合酶，快速离心混匀。循环条件：94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 1 min，循环35次，末次延伸7 min。电泳鉴定，观察目的基因，实验中仅出现一条500 bp β-actin条带为MAL mRNA阴性;同时出现166 bp条带为MAL mRNA阳性。采用数字图像分析仪2200系统观察拍照并进行半定量分析，以MAL/β-actin比值作为MAL mRNA相对表达量，若比值小于25%为表达缺失，若比值小于50%则为低表达，低表达与表达缺失均为异常表达。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 10.0统计软件，对定性RT-PCR结果进行χ2检验及确切概率法;对半定量RT-PCR结果进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 食管癌组织和癌旁组织中MAL mRNA的定性检查结果比较

　　45例食管癌组织中未见MAL表达者28例，弱表达者12例;癌旁组织食管黏膜组织MAL mRNA全部呈阳性表达。食管癌组织中MAL mRNA表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织，差异有显著性(χ2=30.59,P<0.01)。见图1。

　　图1 RT-PCR检测食管癌组织MAL mRNA的表达

　　①、②为食管癌组织MAL mRNA表达阳性;③、④为食管癌组织MAL mRNA表达阴性;⑤为X174/HaeⅢ分子质量标志物

　　2.2 MAL mRNA的半定量RT-PCR检测

　　2.2.1 食管癌组织和癌旁组织中MAL mRNA表达水平比较 本文45例食管癌组织MAL mRNA相对表达水平为0.90±0.11，而癌旁组织中MAL mRNA的表达水平为1.51±0.27，两者比较差异有统计学意义(t=2.329，P<0.05)。

　　2.2.2 食管癌组织MAL mRNA表达水平与临床病理分期的关系 MAL mRNA表达水平与食管癌病人性别、年龄无关，但随临床分期的增高，其表达水平明显降低(P<0.001)，且淋巴结转移阳性者MAL mRNA表达水平显著低于淋巴结转移阴性者(P<0.001)。见表1。表1 食管癌组织MAL mRNA表达水平与临床病理特征的关系

　　3 讨 论

　　MAL基因定位于2q13，共含有4个外显子,其cDNA长为1 051 bp。MAL是T淋巴细胞成熟相关蛋白，它强烈表达于正常食管上皮细胞，1987年ALONSO等[1]报道具有特征性的MAL cDNA克隆呈现在成熟T淋巴细胞上。现已证实，MAL是组成向顶端运输的细胞膜和分泌性蛋白的必不可少的组成部分[2~6]。基于MAL的功能是诱发广泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL在顶端传送体的形成中扮演着重要角色[7,8]。现在已有许多研究证明，MAL表达和人类食管恶性肿瘤相关。有学者报道，MAL基因在食管癌发生的不同阶段均表达下调，且从不同角度分析和探讨MAL基因表达下调的可能机制，MAL的不表达或表达下调在食管癌发生中可能起决定性作用[9,10]。

　　TUGORES等[11]报道，MAL启动子区设计缺失影响转录子失活，没有观察到MAL基因组区有遗传性的修改，而且在13例食管癌细胞株中有3例MAL启动子发生甲基化，9例细胞株中MAL表达正调节。其机制可能为MAL启动子DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基协同作用于MAL基因导致肿瘤发生。然而，现在仍没有明确MAL基因在癌组织中表达是否被其他机制调节，如染色体缺失、突变或其他畸变。功能性测定表明，在癌细胞中外源性MAL的表达可引起细胞运动性降低，在活体内致瘤性下降。本研究采用定性和半定量两种方法研究了食管癌MAL mRNA的表达与性别、年龄、临床分期及组织学分级等因素的关系。结果显示，MAL mRNA的表达缺失在不同性别、年龄中无明显差异，从而推测食管癌MAL mRNA的表达缺失与性别、年龄无关，而MAL基因的表达与食管癌的组织学分级、临床分期也无相关性，与文献[12,13]报道不符，可能与病例数较少有关。本文研究结果显示，食管癌组织 MAL mRNA相对表达量与癌旁组织比较差异有显著性，且随临床分期和组织学分级的增高，其表达水平明显降低，即MAL基因在食管癌组织中表达显著下调。表明MAL基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。国内许智雄等[14]通过PCR分析显示，在食管癌细胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。

　　本文在研究食管癌组织MAL基因的表达同时，也探讨了MAL基因与食管癌淋巴结转移的关系。结果显示，淋巴结转移阳性组MAL的表达显著低于淋巴结转移阴性组(P<0.05)，提示食管癌组织MAL的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，关于MAL基因如何调节食管癌淋巴转移的机制仍不十分清楚。淋巴结转移是食管癌的独立危险因素，MAL的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，因此，MAL基因的表达与食管癌的预后有一定的相关性。目前，关于食管癌MAL基因与淋巴结转移的关系的同类研究尚未见报道，要得到更加准确和客观的结果还需要更大样本量的研究。