—内皮型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病的关联研究

【摘要】目的对内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因-786T/C、4a4b、894G/T等3个多态性位点与中国汉族人群冠心病(CAD)发病的相关性进行联合研究。方法　148例中国汉族CAD患者和115例正常对照进行以下遗传学分析：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和PCR技术分析2个单核苷酸多态性(SNP)位点即-786T/C和894G/T，以及1个可变串联重复序列(VNTR)位点4a4b，检测各位点基因型和等位基因频率，采用HaploView 4.0及SPSS 13.0软件经χ2检验比较两组间各位点基因型及等位基因频率的差异。结果　CAD组中eNOS基因-786T/C位点CC基因型频率以及4a4b位点4a/4a基因型频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。CAD组和对照组在eNOS基因的894G/T位点等位基因和基因型频率分布均无统计学意义(P>0.05)。结论　eNOS基因-786T/C和4a4b多态性与中国汉族人群CAD存在关联，C等位基因和4a等位基因可能是CAD发病的危险因素。eNOS基因894G/T位点与CAD可能无关联。
　　【关键词】 冠状动脉疾病;　一氧化氮合酶;　多态性;　限制性片段长度;　病例对照研究

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the relationship between the 3 polymorphisms (-786T/C,4a4b,894G/T) in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and coronary artery disease (CAD).Methods　148 patients with CAD and 115 healthy unrelated individuals in a Chinese Han population were involved.The genotype and allele frequencies of each polymorphisms of the eNOS gene in these patients and normal controls were examined with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) or PCR methods.Genotypes and allele frequencies were analyzed by HaploView 4.0 and SPSS 13.0 software.Results　There were significant differences in both allele and genotype frequencies of -786T/C and 4a4b between the study and control group.The frequencies of CC genotype of the -786T/C and 4a/4a genotype of the 4a4b in eNOS gene were significantly higher in CAD than that in controls (P<0.05).Between patients with CAD and controls，there were no significant differences in the frequencies of the genotypes and alleles of the 894G/T in eNOS gene.Conclusions　The -786T/C and 4a4b polymorphisms of eNOS gene may be associated with CAD.The individuals with C allele of -786T/C and 4a allele of 4a4b are susceptible to CAD.Between CAD and normal controls，there is no significant association in the and 894G/T polymorphism in eNOS gene.

　　【Key words】　Coronary disease;　Nitric-oxide synthase;　Polymorphism，restriction fragment length;　Case-control studies

　　冠状动脉粥样硬化性心脏病(disease，CAD)，是供应心脏自身血液的冠状动脉发生严重粥样硬化或痉挛而狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死的一种严重心脏疾病，是世界范围内首要的致死性心血管疾病[1]。包括年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病以及遗传易感性等众多因素都会影响CAD的发生发展[1-2]。大量研究表明：内皮功能障碍在作为CAD基本病理表现的动脉粥样硬化的发展过程中起到关键的作用，内皮功能障碍程度可以间接反映CAD的发病程度并提供预后评估[3]。由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)可以通过对血小板聚集，白细胞黏附和平滑肌细胞增殖、迁移的抑制效应发挥对心血管系统的保护作用[3]。动物实验表明，eNOS基因敲除小鼠较之野生型小鼠更易患动脉粥样硬化[4]。基于家系、双胞胎以及寄养子的遗传分析研究表明，CAD的遗传度高达50%，而eNOS基因已被认为是CAD重要的候选基因[5]。
　　eNOS在血管中的表达受到转录或转录后过程的调节，提示eNOS基因表达的可诱导性改变很可能通过NO参与动脉痉挛或是CAD的发生发展[6-7]。近些年的遗传学研究也试图揭示不同人群eNOS基因变体与CAD发病的关系，受到人们广泛关注的变体包括位于基因启动子区的-786T/C，位于第七外显子区的894G/T等单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点以及位于第四内含子区的4a4b可变串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)。虽然一些研究表明上述eNOS基因多态性位点或独立或通过基因和环境的交互作用与CAD的发生具有关联性，然而也有一些文献并没有发现这种关联关系。这种矛盾表明不同人种不同族群CAD的易感位点和它对疾病的贡献度可能存在某些差异。然而，在国内尚未出现eNOS基因上述3个多态性位点的联合研究。
　　基于以上原因，为了进一步明确eNOS基因与中国汉族人群CAD的相关性，笔者通过采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)以及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-polymorphism，restriction fragment length，PCR-RFLP)技术，在国内检测4a4b，-786T/C和894G/T三个多态性位点的基因型，将148例CAD和115例健康人进行对照，用病例-对照研究方法对eNOS基因上述2个SNP位点和1个VNTR位点的基因型及等位基因与CAD发病的关联性进行了探讨。
　　对象与方法
　　一、研究对象
　　选取2007～2010年在新乡医学院附属医院心内科住院的CAD患者148例，均符合1979年WHO关于缺血性心脏病的诊断标准，经冠状动脉造影确诊。造影时，各主要分支存在≥50%狭窄定义为有意义病变。其中男86例，女62例，平均年龄(62.2±13.7)岁。收集115例来自健康体检的无关健康个体作为正常对照组，男67例，女48例，平均年龄(59.4±11.6)岁。所有受试者均为汉族，入组时均排除其他躯体精神疾病以及可能影响血液系统的其他疾病，同时签署知情同意书。
　　二、研究方法
　　采用EDTA抗凝真空采血管收集外周血5 ml，采用北京天根公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃储存备用。PCR反应体系25 μl：基因组DNA 100 ng，灭菌去离子水10 μl， 10×buffer 5 μl,2 mmol/L dNTPs 4 μl,20 μmol/L引物各0.5 μl，Taq酶(5 U/μl)。eNOS基因多态性位点的引物设计参照文献[8-10]，由上海生工合成。-786T/C引物为：上游5′-CAGATGACACAGAACTACAA-3′，下游5′-GAGTCTGACATTAGGGTATCC-3′。PCR扩增循环参数如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环，72 ℃总延伸15 min,4 ℃保存。10 μl PCR反应产物用10 U Nae Ⅰ限制性内切酶(TaKaRa，大连)37 ℃过夜消化;894G/T引物为：上游5′-CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC-3′，下游5′-AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC-3′。PCR扩增循环参数如下：95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环，72 ℃总延伸 15 min，4 ℃保存。10 μl PCR反应产物用10 U Ban Ⅱ限制性内切酶(TaKaRa，大连)37 ℃过夜消化;VNTR 4a4b引物为：上游5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′。PCR扩增循环参数如下：95 ℃预变性5 min,95 ℃变性 30 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环，72 ℃总延伸15 min,4 ℃保存。酶切产物及PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳，经BIO-RAD凝胶成像仪系统处理后进行基因分型判读。
　　三、统计学分析

　　采用HaploView 4.0软件进行Hardy-Weinberg平衡检验，计算病例组和对照组间基因型频率和等位基因频率。采用SPSS 13.0软件进行t检验和χ2 检验，统计分析临床资料和等位基因、基因型频率分布差异，P<0.05为差异有统计学意义。
　　结　　果
　　一、 CAD组和健康对照组临床特征比较
　　148例CAD患者和115例健康对照者的临床资料见表1。CAD组和对照组除了在吸烟史和糖尿病史这两项指标中差异有统计学意义(P<0.05)外，平均年龄、体重指数、性别、高血压史等指标均未发现统计学意义(P>0.05)。
　　二、 CAD组和健康对照组eNOS基因3个多态性位点分型结果比较
　　eNOS基因-786T/C位点扩增产物为单一的338 bp条带，Nae Ⅰ酶切后等位基因片段结果如下：CC型为195 bp和143 bp;CT型为338 bp、195 bp和143 bp;TT型为338 bp。
　　eNOS基因894G/T位点扩增产物为单一的207 bp条带，Ban Ⅱ酶切后等位基因片段结果如下：GG型为125 bp和 82 bp;GT型为207 bp、125 bp和82 bp;TT型为207 bp。
　　eNOS基因4a4b位点扩增产物根据27 bp核心序列的重复次数不同分为：4a/4a型，27 bp重复4次，PCR产物为单一的108 bp条带;4b/4b型，27 bp重复5次，PCR产物为单一的135 bp条带;4a/4b型，杂合型，PCR产物为108 bp和135 bp条带并存。
　　经检验，eNOS基因-786T/C、894G/T和4a4b三个多态性位点的基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，群体具有代表性。上述eNOS基因3个多态性位点的基因型、等位基因频率在正常与疾病组中的分布及统计结果见表2。
　　eNOS基因-786T/C和4a4b位点的基因型及等位基因频率分布在CAD组与正常对照组存在统计学意义(P<0.05)，CAD组的-786T/C位点的等位基因C频率显著高于正常对照组(χ2=7.449，P=0.006，OR=2.273,95% CI=1.245～4.151),4a4b位点的等位基因4a频率显著高于正常对照组(χ2=9.146，P=0.002，OR=2.193,95% CI=1.307～3.680)。而894G/T位点的基因型及等位基因频率分布在疾病和健康对照组之间均未发现统计学意义(P>0.05)。这些结果提示，eNOS基因-786T/C和4a4b位点多态性可能与CAD的发病有关，携带有-786T/C多态性位点C等位基因和4a4b多态性位点4a等位基因的个体更可能患CAD，而894G/T位点可能与CAD的发生发展没有明显的相关性。表1　CAD组和健康对照组临床资料比较表2　eNOS基因3个多态性位点基因型及等位基因频率在CAD及正常对照组中的分布比较

　　讨　　论
　　有关CAD发病的具体分子机制迄今仍未阐明。目前认为，作为一种复杂性疾病，CAD致病过程是多因素的，涉及基因和环境的交互作用。吸烟等环境因素作为CAD发病的风险因素早已为人们所认识，笔者也在本研究中再次发现具有糖尿病史和吸烟史的人更易发CAD。然而，虽然近年来发现了一些CAD发病的候选基因如eNOS，遗传因素独立或是与环境因素叠加参与CAD的发生发展却尚未有明确的结论。有的对于eNOS基因多态性与内皮功能障碍和CAD患者临床表现的相关性的遗传学研究结果并不一致。而近年的荟萃分析的结果支持eNOS基因的某些遗传变异可能能够作为特定群体心血管疾病发病的危险因素之一，预测疾病的发生和发展[11]。
　　本次研究在国内同时选择eNOS基因上被人们广泛关注的三个多态性位点，其中-786T/C位于启动子区，有资料显示该位点变异可能影响eNOS基因的转录起始，导致eNOS合成减少进而使NO生产减少，促进冠状动脉的痉挛[12];属于VNTR的4a4b位点位于第四内含子区，有研究表明4a等位基因携带者血浆NO水平显著降低[13];894G/T位点位于第七外显子，可使eNOS蛋白密码子298的谷氨酸被置换为天冬氨酸，有研究发现该多态性位点与血液中NO浓度下降以及血管反应性下降有关[14]。本研究发现，eNOS基因-786T/C位点的基因型及等位基因频率在CAD组与对照组均存在统计学意义(P<0.05)，CAD组C等位基因频率和CC基因型频率明显高于对照组(P<0.05);4a4b位点的基因型及等位基因频率在两组之间也存在统计学意义(P<0.05)，CAD组4a等位基因频率和4a/4a基因型频率明显高于对照组(P<0.05)。而894G/T位点的基因型和等位基因频率在两组之间未发现存在统计学意义(P>0.05)。结果表明，eNOS基因-786T/C和4a4b多态性位点的基因型和等位基因频率分布与中国汉族人群CAD相关联，等位基因C和等位基因4a可能是CAD的危险因子，携带有-786T/C多态性位点C等位基因和携带有4a4b多态性位点4a等位基因的个体可能更易发生CAD，而eNOS基因894G/T位点多态性分布与CAD发病没有明显的关系。
　　本研究结果支持-786T/C位点的C等位基因和4a4b位点的4a等位基因是CAD发病相关的危险因素，这与以往国内研究结果相一致。冉军川等[15]对中国汉族人群健康群体与CAD的研究表明：-786T/C基因多态性是CAD的遗传危险因素，并独立于CAD其他的经典危险因素。向光大等[16]对2型糖尿病患者研究结果提示携带-786T/C多态性C等位基因明显增高2型糖尿病患者并发CAD的危险性。于辉等[17]以及贺颖等[18]对我国河南地区汉族人群CAD发病易感性的研究结果表明eNOS基因的4a4b与CAD显著相关，4a等位基因携带者具有易患CAD的危险性。然而对于国外的报道，结果却并不一致。对于-786T/C位点，Nassar等[19]及Jaramillo等[20]均报道欧美人群CAD发病的危险性与-786T/C位点多态性无关，而Nakayama等[8]、Kim等[21]以及Alkharfy等[22]则报道亚洲人群即日本、韩国以及沙特阿拉伯人群该位点C等位基因与CAD发病均显著相关。对于4a4b位点，也未有一致结论，高加索人群的研究既有4a等位基因与CAD发病相关的报道[9,23]，也有阴性结果的发现[24]，而对于亚洲人群，Ichihara等[25]、Park等[26]以及Alkharfy等[22]的研究认为亚洲人群即日本、韩国以及沙特阿拉伯人群该位点4a等位基因能显著升高CAD的发病危险性。综合分析以往的研究结果并结合笔者的研究发现，可以认为：eNOS基因分布具有种族和地区差异性，各多态性位点在不同地域不同人群的基因频率分布具有很大不同，亚洲人群和欧美人群分布并不一致，对于-786T/C的C等位基因以及4a4b的4a等位基因，在特定的人群如亚洲人群包括中国汉族人群可以认为是CAD发病的风险因素。值得注意的是，CAD存在临床异质性，早发CAD与迟发CAD在遗传背景方面可能会存在一定差异[27]，这也可能对实验的抽样带来偏倚进而影响实验结果的一致性。
　　关于eNOS基因多态性位点如何引起eNOS功能改变，终影响CAD的发生发展，目前尚未有明确结论。但有研究提示：-786T/C位点能够显著降低eNOS基因启动子活性[12]，而4a4b位点也与血浆中NO水平的降低有明显的关联性[13]。这些结果表明：eNOS基因的这两个与CAD发病相关的多态性位点不仅是作为易患CAD的遗传标记出现，而且还可能通过影响eNOS蛋白的功能直接影响CAD的发生或病程。在后续研究中，笔者将加大样本数，对样本进行临床症状分型以分析特定基因型对于CAD的具体影响，并探讨具体阳性位点与急性冠状动脉综合征、冠状动脉狭窄严重程度以及冠状动脉痉挛的关系[28-29]。同时还需在eNOS基因转录、蛋白表达和功能等方面进行进一步研究，深入阐释eNOS基因多态性对CAD的作用和致病机制。
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