人野生型p53肿瘤抑制基因在烟草中的遗传转化

作者：康杰芳　王喆之
　　【摘要】目的： 构建人野生型p53肿瘤抑制基因的植物表达载体，并建立p53转基因烟草植株. 方法： 将人野生型p53肿瘤抑制基因编码区克隆于pUC19, pBI426和pCAMBIA2301载体，构建含人野生型p53基因的植物表达载体pCAMBIA2301/p53，p53基因由2×CaMV 35S启动子控制表达. 利用叶盘共培养法经根瘤农杆菌EHA105介导转化烟草，获得转基因烟草植株;用组织化学法,PCR、Southern杂交检测转基因烟草植株. 结果： 经组织化学法,PCR, Southern杂交检测表明人野生型p53基因已整合到转基因烟草植株的基因组中，并获得了的转p53基因烟草植株. 结论： 成功建立了含人野生型p53基因的转基因烟草植株，为进一步检测p53基因的生物活性和开辟生产药用蛋白的新途径奠定了基础.

　　【关键词】 人野生型p53基因;转基因烟草;根瘤农杆菌;基因转化;抗菌药
　　【Abstract】AIM: To construct the plant transformation vector containing human wildtype p53 tumor suppressor gene and establish human wildtype p53 transgenic tobacco plants. METHODS: The human wildtype p53 coding sequence was subcloned into vectors pUC19, pBI426 and pCAMBIA2301 to obtain plant ex[x]pression vector pCAMBIA2301/p53. TDNA regions of the pCAMBIA2301/p53 binary vector contained constitutive 2×Cauliflower mosaic virus (2×CaMV) 35S promoter, nopaline synthase terminator, and neomycin phosphotransferase Ⅱ(npt Ⅱ)gene, which allowed the selection of transformed plants against kanamycin. The tobacco (Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xanthi) plants were transformed by cocultivating leaf discs method via Agrobacterium tumefaciens EHA105 harboring the plant ex[x]pression vector. The generated transgenic tobacco plants were selected by kanamycin, and identified by histochemical assay, PCR, Southern blot. RESULTS: Histochemical assay, PCR and Southern blot analyses demonstrated the stable integration of the human wildtype p53 gene into the tobacco genome.Transgenic tobacco plant with p53 gene was obtained successfully. CONCLUSION: Transgenic wildtype p53 tobacco plants have been established, which can serve as a ba[x]se for further studies on detecting the biological activities of p53 gene and exploiting the new way of producing pharmaceutical proteins.

　　【Keywords】 human wildtype p53 gene; transgenic tobacco; Agrobacterium tumefaciens; gene transformation; antibacterial agents

　　0引言

　　人类癌症中常见的基因改变是p53基因突变，它是癌基因研究中重要的肿瘤抑制基因之一，野生型p53基因与细胞周期的生长调节、细胞转化的调节、DNA复制以及诱导细胞程序性死亡有着密切关系[1-2]. 本研究利用转基因植物作为生物反应器的优点，将人野生型p53肿瘤抑制基因构建于植物表达载体，通过根瘤农杆菌介导的转化方法将其转入烟草，获得表达人野生型p53基因的转基因植株，为今后借助转基因烟草或其它转基因植物作为生物反应器生产人野生型p53蛋白奠定了基础.

　　1材料和方法
　　1.1材料

　　1.1.1质粒、菌株人野生型p53肿瘤抑制基因由赵永同博士惠赠，植物表达载体pCAMBIA2301，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，大肠杆菌(Ecoli.)DH5α，pUC19为本实验室保存.

　　1.1.2主要试剂各种限制性酶、Tag聚合酶、质粒快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司和上海生工生物工程技术服务有限公司;高效地高辛 DNA标记检测试剂盒购自Roche Molecular Biochemicals公司. 头孢曲松钠购自上海先锋药业公司;卡那霉素购自华美生物工程公司，其他常规试剂均为国产分析纯试剂.

　　1.1.3培养基LB及MS 培养基按参考文献方法配制[3]. 浸染培养基：MS0+ AS(400μmol/L)+ pluronic F68 (0.5 mg/L)，AS和pluronic F68在浸染前加入. 共培养基：MS+BA(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L) + AS (400 μmol/L)+pluronic F68 (0.5 mg/L). 选择培养基：MS+BA (1 mg/L)+ NAA (0.1 mg/L )+Kanamycin (100 mg/L)+头孢曲松钠. 头孢曲松钠浓度依次为50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L. GUS显色液按参考文献方法配制[4].

　　1.1.4植物材料烟草(Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xianthi)为本实验室保存的无菌苗.

　　1.2方法

　　1.2.1人野生型p53肿瘤抑制基因植物表达

　　载体的构建人野生型p53肿瘤抑制基因两端酶切位点为BamHⅠ和NotⅠ，经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接于载体pUC19中，得到重组载体pUC19/p53;分别将pUC19/p53和pBI426的质粒用BamHⅠ和SstⅠ双酶切，经T4 DNA ligase连接，得到中间载体pBI426/pUC19/p53，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，回收目的片段，连接到 pCAMBIA2301载体中，得到植物表达载体pCAMBIA2301/p53，提取质粒，酶切鉴定，测序证实，通过冻融法[4]转化到根瘤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens ) EHA105中.

　　1.2.2根瘤农杆菌的培养

　　挑取含pCAMBIA2301/p53质粒的根瘤农杆菌单菌落，接种于10 mL附加200 mg/L利福霉素和100 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中(pH 7.0)，28℃，180 r/min恒温振荡培养过夜. 当培养至菌液A600约为0.6时收集菌液，5000 r/min离心5 min，沉淀重悬于2倍体积的浸染培养液中以供转化用.

　　1.2.3烟草的遗传转化
　　参照Horsch等[5]方法，采用叶盘共培养法进行烟草的遗传转化. 从烟草无菌苗上选取幼嫩叶片，切成0.5 cm×0.5 cm小片，在农杆菌浸染液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸干多余菌液，将叶片表面向下置于共培养基上，在28℃暗培养条件下共培养3~4 d. 同时设空根瘤农杆菌EHA105浸染对照及未浸染对照.

　　将上述共培养叶片转移至选择培养基上，在每日光照16 h,光照强度4000lx, 28℃条件下进行培养，诱导抗性愈伤组织的形成. 当愈伤组织长出新生芽至1 cm时，切下小芽转入新的选择培养基诱导分化. 每18 d左右更换一次选择培养基，待根系形成，幼芽长至8~10 cm后炼苗，移入温室种植.

　　1.2.4转基因烟草的GUS活性检测
　　取转基因烟草叶片少许，放入平皿中，加入GUS显色液，使叶片完全淹没在溶液中，37℃保温2 h后观察.

　　1.2.5转基因烟草的PCR检测
　　参照CTAB方法，分别提取转化植株和未转化植株叶片基因组DNA，进行PCR扩增，根据wtp53基因设计上下游引物，P1: 5′CCAAGCAATGGATGATTTGATG3′，P2: 5′GAGTTTTTTATGGCGGGAGGTA3′(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，扩增条件为：95℃变性5 min，94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s，35个循环，72℃延伸10 min. PCR反应产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测.

　　1.2.6转基因烟草的Southern blot检测
　　提取PCR检测阳性植株的叶片基因组DNA，用HindⅢ酶切，地高辛随机引物标记探针并进行Southern杂交检测，方法按照Roche试剂盒说明进行.

　　2结果

　　2.1pCAMBIA2301/p53植物表达载体的构建含有2×CaMV35S启动子、增强子、终止子、报告基因gus, 卡那霉素抗性基因nptⅡ, 左右两侧25 bp边界序列(图1)，通过冻融法转化到农杆菌EHA105中.

　　2.2烟草叶片的转化及转化植株再生体系的建立
　　2.2.1转基因烟草植株的再生浸染过含人野生型p53基因的农杆菌菌液的烟草叶片在附加200 mg/L 头孢曲松钠、100 mg/L卡那霉素的选择培养基上培养14 d左右，叶片边缘处膨大，长出抗性愈伤组织，将其切下转入新的选择培养基中，抗性芽继续生长，一部分黄化死亡，另一部分生长为正常的绿色芽，当不定芽长至3~5 cm时转入新的选择培养基，部分小苗可长大并产生不定根，发育为完整的再生植株(图2)，即Km抗性表型的再生植株.2.2.2抗生素头孢曲松钠在转基因烟草中的作用

　　当头孢曲松钠的浓度为200 mg/L时，抑菌率、愈伤组织诱导率和不定芽平均增殖率都达到高，之后随着浓度的增加愈伤组织诱导率和不定芽平均增殖率有所下降.

　　2.3转基因烟草植株的检测
　　① 具有GUS酶活性(图2F)，GUS基因已经整合进入烟草基因组，并且能够稳定表达，与GUS基因相连的目的基因人野生型p53基因也转化到烟草基因组中;② 盆栽的12 株抗性再生植株经PCR 扩增反应均能扩增出1039 bp的预期DNA片段(图4);

　　③ 对PCR检测阳性的转化植株随机选取8株，提取总基因组DNA显示Southern Blot阳性率为87.5%(获得7株转基因植株)，表明外源人野生型p53基因已经整合到烟草基因组中(图5).

　　3讨论

　　人类p53基因的缺失或失活与50%以上肿瘤的发生、发展相关，基因突变是p53基因正常功能丧失的主要方式，大量体外培养细胞和动物模型都证实了外源的wtp53导入后，肿瘤细胞增殖减慢，细胞发生凋亡，瘤体体积缩小，对放、化疗药物的敏感性增高[6-7]. 因此获得大量、廉价、安全且具有正常功能的wtp53基因便成为p53抑癌基因治疗的首要任务. 利用转基因植物作为生物反应器生产重组药用蛋白具有常规的微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统不可比拟的潜在优越性，目前已有人胰岛素、免疫球蛋白、干扰素、人表皮生长因子、尿激酶、葡萄糖脑苷脂酶、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人生长激素脑啡肽等多种药用蛋白在转基因植物中表达并生产[8]. 本实验构建了人野生型p53肿瘤抑制基因的植物表达载体pCAMBIA2301/p53，该载体具有完整的植物表达调控元件，如组成型启动子2×CaMV35S,连接外源基因的多克隆酶切位点，卡那霉素抗性基因nptⅡ,标记基因gus及左右边界序列，可与农杆菌中的Ti 辅助质粒构成植物双元表达载体，适用于根瘤农杆菌介导的植物转化，并获得了大量抗性植株. 经组织化学法, PCR, Southern杂交检测，表明人野生型p53基因已整合到转基因烟草植株的基因组中，获得了含人野生型p53基因的烟草转化植株，为进一步检测p53基因的生物活性奠定了基础.

　　农杆菌介导的基因转化中常用的抑菌抗生素由于其种类较多，抑菌效果也有差异. 这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用，而且对植物细胞组织同样有一定的生物效应[9]. 本实验选用的抑菌抗生素头孢曲松钠为第三代头孢类抗生素，是目前半衰期长的头孢菌素之一，属于β内酰胺类抗生素，是分子结构中含有头孢烯结构的合成半合成抗生素，它与青霉素类结构的不同在于母核7氨基头孢烷酸 (7ACA) 取代了6氨基青霉烷酸 (6APA)，这种差异使头孢类抗生素可以耐青霉素酶，其作用机理与青霉素类相似，为繁殖期强效杀菌剂，可与蛋白结合抑制转肽酶交联反应，从而阻碍细胞壁粘肽的合成，使细菌的细胞壁缺损，菌体高渗膨胀裂解，进而诱导粘肽水解酶激活而溶菌. 本实验中头孢曲松钠在适宜的浓度下，抑制农杆菌生长的同时能提高烟草愈伤组织诱导率和丛生芽诱导率，有类似激素的活性.

　　【参考文献】
　　[1]高丰，宋今丹. p53家族新成员研究进展[J]. 国外医学遗传学分册,2000,23 (2):66-71.

　　[2]Mirza A, McGuirk M, Hockenberry TN, et al. Human surviving is negatively regulated by wild type p53 and participates in p53 dependent apoptotic pathway[J]. Oncogene, 2002,21(17):2613-2622.

　　[3]王关林,方宏筠. 植物基因工程原理和方法[M]. 北京: 科学出版社,2002:350-355.

　　[4]Jfferson RA. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system[J]. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5(4): 387-405.

　　[5]Horsh RB, Fry JL, Hoffman NC, et al. A simple and general method for transfering genes into plants [J].Science, 1985,217:1229-1231.

　　[6]Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, et al. A retroviral wildtype p53 ex[x]pression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis[J]. Cancer Res, 1993,8:4129-4133.

　　[7]Toschi E, Rota R, Antonini A, et al. WildType p53 gene transfer inhibits invasion and reduces matrix me[x]talloproteinase2 levels in p53mutated human melanoma cells[J]. J Invest Dermatol, 2000,114:1188-1194.

　　[8]程霞英,杨宗岐. 转基因植物生产药用蛋白研究进展[J]. 生物技术,2005,15(2):86-88.

　　[9]Okkel FT, Pederson MG, The toxicity to plant tissue and to Agrobacterium tumefaciens of some antibiotics[J]. Acta Hort, 1998,225:199-207.