微小RNA-21真核表达载体构建及其对甲状腺乳头状癌细胞程序性细胞凋亡4蛋白的影响

　　微小RNA(miRNA)是一种在真核生物中发现的内生性RNAs，长约21一23个核昔酸，通过调节靶mRNA的转录导致降解或者翻译抑制，在动植物体中发挥着重要的调节作用。研究表明，异常表达的miRNA、与许多肿瘤，包括甲状腺乳头状癌都密切相关，在肿瘤的发生过程中起到癌基因或抑癌基因的作用，并和预后不良有关}3}omiR-21是发现较早的miRNA之一，也是目前发现与不同类型肿瘤相关miRNAs中多的1个}a}，其位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域，具有自主转录单位。研究表明，miR-21在多种肿瘤中显著高表达。本实验旨在构建miR-21的真核表达载体pEZX-eGFP-miR-21，将其转染至甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中，使其在TPC-1中瞬时高表达，观察高表达的miR-21对程序性细胞凋亡4(PDCD4)蛋白表达的影响。 　　

　　材料和方法 　　

　　1.材料:Lipofectamine2000，MReagent(Invitrogen公司)、miRNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),miRNAcDNA第1链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、HiFi-MMLVcDNA第1链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),2xmicroRNAQPCRpremix(wiChSYBRandRox)(北京康为世纪生物科技有限公司)、质粒抽提试剂盒。大肠杆菌DHSa由本室保存、限制性内切酶,T4DNA连接酶等。 　　

　　2.miRNA-21基因合成及载体构建:根据miRNA-21基因序列设计正、反义DNA序列。两端分别加BamHI/HindIII酶切位点。将合成的单链DN.4经退火后合成双链DNA序列。pEZX-eGFP经BamHI/HindIII双酶切后电泳回收酶切产物。通过T4DNA连接酶将酶切后的质粒和DNA片段16℃连接过夜。连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌DH5a，菌落聚合酶链反应(PCR)法筛选阳性菌落，提取质粒进行双酶切鉴定及测序。 　　

　　3.细胞培养及转染:甲状腺乳头状癌细胞TPC-1由本实验室保存;TPC-1的培养条件为含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，370C,5%C0}培养转染前1d，将处于对数期生长的甲状腺乳头状癌细胞TPC-1用0.5%胰蛋白酶进行消化，计数后稀释成所需的密度，在含DMEM完全培养基(不含抗生素)的6孔板中接种该细胞，每孔3x106个细胞，每组各设3个复孔。至细胞融合度达90%，利用脂质体转染试剂Lipofectamine2000TM，按说明书进行转染。实验分为3组(每组设3个复孔):(1)转染pEZX-eGFP-miR-21重组质粒组为实验组;(2)转染pEZX空载体组为阴性对照组;(3)未转染组为空白对照组。 　　

　　4.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测转染后细胞miRNA-21的表达:pEZX-eGFP-miR-21重组质粒转染TPC-1细胞48h后，利用miRNA提取试剂盒提取总miRNA、用加尾法及茎环法分别进行逆转录，通过荧光PCR试剂盒用特异引物对miR-21进行扩增，同时以U6作为内参，进行FQ-PCR反应。 　　

　　5.Westernblot法检测细胞PDCD4蛋白表达:转染48h后，去培养液，将培养板倒扣在吸水纸上，吸干培养液;胰酶消化细胞后，加人细胞裂解液RIPA100闪，重悬细胞并反复吹打3一5min;转人EP管后4℃12000r/min离心5min;吸取上清，考马斯亮蓝溶液定量处理后于十二烷基硫酸钠一聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上电泳2h，以p一肌动蛋白(日-actin)作为参照物，至澳酚蓝刚跑出即终止电泳;取出凝胶，转移缓冲液浸泡20min;将切好的硝酸纤维素及凝胶置于转膜缓冲液中平衡2h，按照海绵、滤纸、凝胶、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、滤纸、海绵的顺序组装后进行转膜。转完膜后将膜用1x丽春红染液于脱色摇床_[摇染5min，用水冲洗膜至看到膜上的蛋白条带。 　　

　　将PVDF膜标记后置于5%的脱脂奶粉(TBS配制)中封闭，室温下脱色摇床上摇动2h，弃封闭液;将PVDF膜置于封闭袋中，加人兔抗人PDCD4IgG单抗(用5%的脱脂奶粉稀释1:1000)，室温下孵育2h，于脱色摇床上用TBST洗脱3次，每次10min;TBS洗脱后的PVDF膜置于新的封闭袋中，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔PDCD4(用TBST稀释至1:2000)，室温下孵育1h后，弃二抗，TBST洗脱;再用TBS洗脱10min;将PVDF膜用保鲜膜包好，凡B试剂1:1等体积混合后均匀覆盖在PVDF膜表面，暗室中曝片。然后进行显影、定影及图像处理。 　　

　　6统计学方法:计量资料均应用SPSS17.0统计软件分析。两样本比较采用配对设计两两比较t检验，组间显著性检验采用单因素方差分析(One}'ayANOVA)，数据以均数士标准差表示。 　　

　　结果
　　1.miR-21的真核表达载体pEZX-eGFP-miR-21测序分析鉴定:经过酶切验证分析正确的克隆送北京金唯智生物科技有限公司测序，测序结果与DNA序列数据库GeneBank中的序列一致，经测序，插人序列与GeneBank中录人的miR-21-3'UTR序列同源性达98%以上。 　　

　　2.FQ-PCR检测转染后细胞miR-21的表达差异:与对照组比较，转染组的细胞中miR-21相对表达水平明显上调，加尾法中是对照组的6.39倍(P<0.01);茎环法中是对照组的7.58倍(P<0.01);阴性对照组的细胞中miR-21表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.OS，表1,2)。miR-21FQ-PCR扩增曲线及熔解曲线显示引物特异性较好，无特异性扩增和引物二聚体干扰。 　　

　　3.Westernblot结果:Westernblot结果显示，3组细胞PDCD4蛋白条带均存在，3组细胞价actin均有阳性表达，且表达量基本相同。利用QuantityOne软件对PDCD4蛋白的相对含量进行分析，可见:与转染空质粒pEZX(0.43士0.07)及未转染(0.82士0.O5)的TPC-1比较，转染重组质粒pEZX-eGEP-microRNA-21后，PDCD4编码的蛋白表达降低((0.24士0.03,P<0.O5，图1).
　　讨论
　　甲状腺癌多起病隐匿，常以无痛性甲状腺结节为初临床表现，早期诊断较为困难。因此，研究鉴定早期诊断预警分子，是目前甲状腺癌临床研究所面临的瓶颈问题，有重要临床意义。 　　

　　miR-21是目前发现的与不同类型的肿瘤相关miRNAs中多的1个基因。miR-21在多种肿瘤如肝癌、胆管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌及其他头颈部实体瘤中显著高表达，但是，miR-21的表达水平在个别肿瘤中也会出现低表达，如促肾上腺皮质素分泌型垂体瘤的miR-21表达量较正常垂体组织低2.4倍。根据以上大量研究结果提出了一种假说，高表达miRNAs通过抑制抑癌基因发挥癌基因作用，低表达miRNAs则失去对抑癌基因的抑制而发挥抑癌基因的作用。 　　　　PDCD4初是通过其在凋亡细胞中作为正性调节转录本而鉴定出来的，与人核细胞翻译起始因子(eIF4A)结合，从而抑制核糖体复合物的形成和蛋白质的合成，促进细胞凋亡，是重要的肿瘤抑制因子，在多种肿瘤细胞中呈现低表达或缺失状态，通过抑制蛋白的转录和翻译来发挥其抑制肿瘤生长的作用。 　　
　　因此，PDCD4可以作为肿瘤疾病临床诊断、判断预后以及治疗的观察指标。miR-21在甲状腺乳头状癌中高表达〔72}，但对于miR-21在甲状腺乳头状癌中的作用机制尚不清楚，基于此，我们采用在大多数哺乳动物细胞中稳定表达的真核表达载体pEZX构建重组质粒pEZX-eGFP-miR-210测序结果显示该载体构建成功，瞬时转染甲状腺乳头状癌细胞TPC-1后，由于真核载体pEZX含巨细胞病毒(CMV)启动子、氨节青霉素抗性基因和新霉素抗性基因以及牛生长激素基因(BGH)聚腺普酸加尾信号和猴病毒40(SV40)早期启动子、使miR-21在细胞中瞬时高表达。这为我们进一步研究miR-21在甲状腺乳头状癌中的作用提供了基础。本实验结果显示，甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中miR-21表达增高可以导致PDCD4蛋白表达的降低。这提示在甲状腺乳头状癌中PDCD4是miR-21的直接靶基因。在TPC-1中miR-21通过作用于PDCD4来抑制细胞凋亡，从而发挥癌基因的作用miR-21,PDCD4可以作为预警分子，用于甲状腺乳头状癌的早期诊断。本研究结果表明，沉默细胞miR-21基因使PDCD4在甲状腺乳头状癌细胞中重获表达，可能恢复PDCD4对癌细胞的生长抑制作用，进而直接促进细胞的凋亡。 　　

　　参考文献 　　

　　孙铁为,王瑾,吴德全. 微小RNA对肿瘤影响的研究进展[J].中华实验外科杂志,2007,(12):1607-1608.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.066.
　　Zhang B,Pan X,Cobb GP. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].Dev Bid,2007.1-12.
　　Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K. Reduced ex[x]pression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Research,2004.3753-3756.
　　Krichevsky AM,Gabriely G. miR-21:a small multi-faceted RNA[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine,2009,(1):39-53.doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00556.x.
　　Fujita S,Ito T,Mizutani T. miR-21 Gene ex[x]pression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J].Journal of Molecular Biology,2008,(3):492-504.doi:10.1016/j.jmb.2008.03.015.
　　Chan SH,Wu CW,Li AF. miR-21 microRNA ex[x]pression in human gastric carcinomas and its clinical association[J].Anticancer Research,2008,(2A):907-911.
　　Si ML,Zhu S,Wu H. miR-21-mediated tumor growth[J].Oncogene,2007,(19):2799-2803.doi:10.1038/sj.onc.1210083.
　　Shibahara K,Asano M,Ishida Y. Isolation of anovel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene,1995.297-301.
　　Zhang H,Ozaki I,Mizuta T. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-betal-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2006,(45):6101-6112.doi:10.1038/sj.onc.1209634.
　　Matsuhashi S,Narisawa Y,Ozaki I. ex[x]pression patterns of programmed cell death 4 protein in normal human skin and some representative skin lesions[J].Experimental Dermatology,2007.179-184.