单细胞分析揭示靶向CD19的CAR-T疗法复发的机制

靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法已经在复发/难治性急性淋巴白血病 （ALL） 等恶性血液肿瘤的治疗中取得了令人惊喜的效果，多中心临床试验数据表明患者接受CAR-T治疗后的完全响应率可达70-90%。目前，美国 FDA 已经批准了6款自体 CAR-T 细胞产品上市，用于治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液类癌症。大量的临床应用结果证明了这种个性化的疗法极具抗癌潜力，没有免疫排斥的风险，安全性也比较高，给全球众多癌症患者带来了希望。 

遗憾的是，随着随访时间的增长， 有30-60%的病人在回输 CAR-T 后一年以内复发 。根据癌细胞表面抗原的表达情况，复发可分为 CD19 阴性和 CD19 阳性两大类，前者主要由癌症 B 细胞 CD19 表达丢失或下调导致，而后者的分子机制尚不清楚。 

该结果进一步通过独立的流式分析和 IsoPlexis 分泌蛋白检测在49名病人的 CAR-T 功能特性表征中得到了验证。

根据患者的临床反应，研究团队将12名患者分为长期完全缓解组 （CR，超过54个月无复发，n=5） ，CD19 阳性复发组 （RL，中位复发时间=9.6个月，n=5） 和无响应组 （NR，n=2） ，获取了 CAR-T 细胞在未激活、CD19 抗原特异性激活、T 细胞受体激活和非靶点激活条件下的全基因转录组和14种表面蛋白组信息。 通过细胞因子共表达模块分析，研究团队首先发现在抗原特异性激活条件下， Type 2  （Th2） 细胞集中分布在 CR 组 CAR-T 富集的区域，且 Th2 模块在 CR 组中的比例显著高于 RL 组。高度差异表达基因分析进一步识别到了 Th2 相关细胞因子 IL4、IL5、IL13 在 CR 组的上调和 Th2 pathway 的显著激活。 接下来，对 CR 和 RL 病人 CAR-T 细胞集的聚类分析识别出8个具备独特转录组特征的亚群，其中亚群4中的细胞具有突出的 Th2 功能。通过细胞占比统计，发现 CR 组 CAR-T 在亚群4中的比例显著高于 RL 组。此外，从 IL4、IL5、IL13 以及主导 Th2 细胞分化的转录因子 GATA3 的单细胞表达分布点状图中可以看出，无论是表达水平还是表达频率，CR 组5名病人都明显高于 RL 组。 

为了验证上述发现，研究团队额外表征了49名 B-ALL 病人的 CAR-T 细胞，其中26名病人具备中位33.7个月的无复发完全响应，另外23名病人在中位9.3个月发生 CD19 阳性复发。双方研究人员独立开展了胞内流式分析（宾夕法尼亚大学）和 IsoPlexis 自动化分泌蛋白检测（耶鲁大学），两种方法共同证实了 Th2 功能在 RL 组中的缺失。 该项研究通过细胞因子共表达模块、无监督学习聚类和经典信号通路分析从激活 CAR-T 的功能异质性中识别出了 Th2 功能在维持 CAR-T 长久缓解中的重要作用，揭示了当前 CAR-T 细胞免疫疗法领域十分关切的 CD19 阳性复发机制，为临床实践中预测响应和筛选病人提供了目标基因、明确了关键通路，也为提高 CAR-T 功效和改善治疗效果提供了理论基础。