海洋新放线菌及其次级代谢产物研究进展

作者：王淑霞 朱天骄 卢圳域 顾谦群* 朱伟明*

作者单位：教育部海洋药物重点实验室 山东省海洋药物重点实验室 中国海洋大学医药学院， 青岛266003

【摘要】  由于自身特殊的生存环境，海洋放线菌具有复杂独特的代谢途径，产生了诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，这些活性代谢产物为新抗生素的发现提供了丰富的先导化合物，有些已经进入临床前研究。本文简要介绍近十几年从海洋样品中分离到的放线菌新种属及其次级代谢产物研究概况。

【关键词】  海洋放线菌； 代谢产物； Salinispora； Verrucosispora； Marinispora

    Recent progress in the discovery of new marine-derived actinomycetes

    and their secondary me[x]tabolites

    Wang Shu-xia,  Zhu Tian-jiao,   Lu Zhen-yu,  Gu Qian-qun  and  Zhu Wei-ming

    (Key Laboratory of Marine Drugs of Ministry of Education, China, Key Laboratory of Marine Drugs of Shandong Province,

    School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China,  Qingdao 266003)

    ABSTRACT  Due to the special living environment, marine-derived actinomycetes possess distinct and complex me[x]tabolic capabilities, resulting in wide diversity of their secondary me[x]tabolites in chemical structure and biological activity. Among them, many valuable leading compounds were obtained for discovery of new antibiotics, and some had been selected for preclinical study. The research advances in discovery of new actinomycetes and their secondary me[x]tabolites were briefly reviewed in this paper.

    KEY WORDS  Marine-derived actinomycetes;me[x]tabolites;Salinispora;Verrucosispora;Marinispora

    放线菌是一类高(G+C)%的革兰阳性细菌，与人类关系密切。现已发现的天然抗生素中70%来自于放线菌家族［1］，如链霉素、阿奇霉素、万古霉素等，在临床上都有非常广泛的应用，为人类健康做出了巨大的贡献。

    随着抗生素的广泛使用，致病菌耐药性急剧增加，原有的抗生素疗效已经大幅度降低，新的疾病不断出现，这些都给抗生素发展带来了巨大的挑战，发现新菌种以寻找新型抗生素成为迫切的需要。但经过50年多年的探索从陆生放线菌中发现新菌种、新抗生素的机率大大降低［2］，于是人们把眼光投向曾经一直被忽略的一个巨大的资源宝库——海洋［3］。

    海洋环境具有高盐度、高压、低温、低营养等特点，在这种特殊环境中生存的海洋放线菌，必然发展出不同于陆生放线菌的独特的代谢途径，这为新菌种、新的活性化合物的发现提供了条件。近十几年对海洋放线菌的研究结果也充分证明了这一点。现已从海洋放线菌中分到了很多结构新颖、生物活性广泛的新化合物［4］，为新抗生素的发现提供了宝贵的先导化合物资源，有的化合物已经进入临床前研究阶段，如salinosporamide A。本文对近十几年发现的海洋放线菌新种属及其次级代谢产物进行简要综述。

    1  海洋放线菌新种属

    近十几年研究发现海洋放线菌在种类上与陆生放线菌不同，陆生放线菌主要以链霉菌为主；海洋放线菌随着样品采集深度的增加，链霉菌逐渐减少，而含有分枝菌酸的放线菌(mycolata)增多［5］，发现的新种属也主要是这一类(表1)。

    2  次级代谢产物研究

    2.1  Salinispora属

    1991年Fenical小组从海泥样品中分离得到一类依赖海水生长的特殊放线菌MAR1，这也是发现的需盐生长的放线菌［6］，对其16S rRNA序列分析表明它们是小单孢菌科的一个新属［3］，首先命名为Salinospora，后更名为Salinispora。Salinispora属放线菌，广泛存在于热带、亚热带的海泥中，此外也存在于其它生物体内，如2005年，Tae等从采自大堡礁的一株海绵Pseudoceratina clavata中也分到了这个属的菌株［7］。现已分离到Salinispora属放线菌2500多株，目前已经确定了三个种Salinispora tropica、Salinispora arenicola［8］和Salinispora pacifica［9］。这个属的菌株发酵粗提物具有广泛的生物活性［3］，对本属菌株的代谢产物进行了化学和生物学研究，发现了一系列结构新颖的高活性化合物。

    2003～2005年，Fenical小组从菌株Salinispora tropica CNB-392中分离得到8个γ-内酰胺类化合物1～8［10，11］，其中salinosporamide A(1)对人结肠癌细胞HCT-116的半数抑制浓度(IC50)为0.035nmol/L。对NCI 60种癌细胞系的半数生长抑制浓度(GI50)小于11nmol/L，进一步的活性评价发现，化合物1对非小细胞肺癌(NCI-H226)、中枢神经癌(SNB-75)、黑色素瘤(SK-MEL-28)及乳腺癌细胞(MDA-MB-435)具有强的细胞毒活性，其半数致死浓度(LC50)均低于11nmol/L，但是对非白血性白血病(CCRF-CEM)、前列腺癌(DU-145)作用微弱(表2)，这表明1具有良好的选择性细胞毒活性，这种独特的选择性，对于成药来说是非常有利的。由于1与蛋白酶体抑制剂omuralide(9)具有相同的母核结构，故对1进行了蛋白酶体抑制活性的测试。测试结果发现1是强效蛋白酶体抑制剂，对糜凝乳蛋白酶体的IC50达到1.3nmol/L，抑制活性约为9的35倍。蛋白酶体参与人体许多调控蛋白质更新和加工过程，因而蛋白酶体抑制剂具有广泛的药理作用，如抗癌、逆转耐药、治疗炎性细胞因子活化诱发的疾病等［12］。这些都预示着1具有非常广阔成药前景。目前1已经作为癌症治疗药物进入临床前研究［13，14］。

    对该菌株的发酵条件进行优化，又发现了两个结构新颖的卤代大环内酯类化合物sporolides A(10)和sporolides B(11)［15］，11对人结肠癌细胞抑制浓度大于78μg/ml，对耐甲氧西林的金葡菌(Staphylococcus aureus)抑制浓度超过250μg/ml。虽然9和10活性较差，但其新颖独特的结构让人们看到海洋放线菌产生新型次级代谢产物的巨大潜力。

    2005年，Fenical小组又对这个属的另一株放线菌Salinispora pacifica CNS103的次级代谢产物进行了一系列研究，发现了两个结构新颖的化合物cyanosporasides A(12)和cyanosporasides B(13)［9］。对其活性评价目前正在进行中。12和13是海洋放线菌次级代谢产物化学多样性的又一例证。

    2006年，Fenical小组从菌株Salinispora arenicola CNR005的发酵液中得到两个新颖的聚酮类化合物saliniketal A(14)和saliniketal B(15)［16］。14和15没 表1        海洋放线菌新种属表2  Salinosporamide A对NCI部分癌细胞系的LC50有鸟氨酸脱羧酶抑制活性，但是与一种强效鸟氨酸脱羧酶激动剂TPA联合使用时，可抑制其激动作用，IC50分别为(1.95±0.37)和(7.83±0.12)μg/ml。鸟氨酸脱羧酶是多胺生物合成途径的限速酶，激动此酶会促进细胞增殖，被认为与癌症发病有关，而鸟氨酸脱羧酶抑制剂则有可能成为有效的防治癌症的药物。因此14和15具有成为先导化合物或候选药物的潜力。

    2.2  Verrucosispora属

    Verrucosispora属早是在1998年Rheims等从沼泽淤泥中分离得到［17］。2004年Bister等从日本海289米深的海底泥样中分离得到菌株AB-18-032，化学分类学及16S rRNA序列分析表明是一个本属新种Verrucosispora sp.。对其次级代谢产物研究得到了一类多环聚酮类抗生素abyssomicin B～D(16～18)［18］，其中abyssomicin C(17)可强烈抑制革兰阳性菌的生长，甚至可以抑制耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的生长。对MRSA N315的MIC为4μg/ml，对耐万古霉素(vancomycin)的MRSA Mu50的MIC为13μg/ml。对其抑菌作用机制的进一步研究发现，此化合物是通过作用于叶酸代谢过程而抑制细菌的生长，但其作用机制与磺胺类药物不同，磺胺类药物是通过竞争性拮抗PADA(对氨基苯甲酸)，干扰细菌酶系统对PADA的利用，从而影响叶酸辅酶的生成。Abyssomicin C是通过抑制细菌体内PADA的合成从而抑制叶酸辅酶的生物合成［19］。这是一种新的抑菌作用靶点，对寻找新型高效抗生素具有积极作用， 为抗生素的发展提供了新的方向。

    2.3  Marinispora属

    发现Salinispora属之后，Fenical小组又展开了一系列调查，以寻找新的海洋放线菌，Marinispora属(MAR2)就是在这个过程中发现的。Marinispora属也是专属海洋性的放线菌，是链霉菌科的一个新属［20］，目前已从不同的采集地点的海泥样品中分离得到了20株本属菌株，表明Marinispora属在海洋环境中也是广泛存在的。对本属菌株CNQ-140次级代谢产物采用活性追踪的方法分离得到了一系列高活性的大环内酯类化合物marinomycins A～D(19～22)［21］。活性测试结果表明19～22具有强的抗菌和细胞毒活性。其中活性显著的是marinomycins A(19)，它对MRSA和耐万古霉素的粪链球菌(VRSF)的MIC90均达到

    .13μmol/L。在NCI 60株癌细胞系的活性测试中发现此类化合物具有特异的组织选择性细胞毒活性，19对八种黑色素瘤细胞系中的六种(LOX IMVI、M14、SK-MEL-2、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62)具有强烈的抑制作用，尤其是对SK-MEL-5，其LC50达到5.0nmol/L。20和21的平均LC50达到0.9和0.2μmol/L。更值得瞩目的是这些化合物对非白血性白血病癌细胞只有非常微弱的抑制作用，LC50约为50μmol/L。这不仅表明了此类化合物具有组织选择性，更预示此类化合物如果成药，其骨髓抑制的不良反应有可能很小。

    2.4  MAR4

    MAR4也是Fenical小组在发现Salinispora属之后发现的另一个链霉菌新种［22］，对这个种部分菌株的次级代谢产物研究表明，本种是一类罕见的、产混源萜类(meroterpenoids)化合物的放线菌［23］。1992年从菌株CNB-632中分离得到marinone(23)和debromomarinone(24)［24］。2000年，从菌株CNH-099中分离得到neomarinone(25)和一系列marinone的衍生物isomarinone(26)、hydroxydebromomarinone(27)和methoxydebromomarinone(28)。对25～28进行了抗肿瘤活性测试发现这些化合物具有中等抗肿瘤活性，对肿瘤细胞HCT-116的平均IC50约为8μg/ml［25］。28对NCI 60种癌细胞系的平均IC50达到10μmol/L。2005年从菌株CNQ-525中分离得到5个萜类化合物29～33，对29～32进行了抗菌和抗肿瘤活性测试，结果见表3［26］，这些化合物对耐药菌具有强的抑制作用和细胞毒活性。其中30的抑菌活性较差，但抗肿瘤活性较好，其构效关系有待进一步研究。2006年，从菌株CNQ766中分离得到两个聚酮类化合物actinofuranones A(34)、actinofuranones B(35)和一个新的混源萜类化合物azamerone(36)［23，27］， 其抗肿瘤活性正在表3    化合物26～29的抗菌及抗肿瘤活性测试中。

    综上所述，海洋放线菌与陆生放线菌的次级代谢产物在结构、活性方面存在着很大的差异。与陆生放线菌相比，海洋放线菌的次级代谢产物分子中多含有卤族元素、多为内酯和内酰胺以及萜类化合物；其次级代谢产物具有新的抗菌作用靶点、对肿瘤细胞和耐药性致病菌表现出较强的抑制作用。

    3  结语

    总之，近十几年的研究结果表明，海洋环境中存在着一个巨大的海洋放线菌资源宝库。生活在海洋这一特殊环境中的放线菌，其生理生化和16s rRNA等分子生物学特征与陆生放线菌有很大的区别，其次级代谢途径亦不同于陆生放线菌，从而产生了结构类型新颖多样、生物活性显著的次级代谢产物，为新型抗生素的发现提供了重要的先导化合物和新的药物作用靶点。随着研究的深入，海洋放线菌将成为发现新抗生素的重要资源。

 

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