脱落细胞检测方法在口腔癌早期诊断中的应用研究

作者：刘彤 孙正 首都医科大学口腔医学院口腔黏膜科；张辛燕 首都医科大学口腔医学研究所

癌症是影响人类健康和生存的重大疾病。世界卫生组织报道，在2012年癌症共造成820万人死亡，其中约70%发生在中低收入国家。中国作为大的发展中国家，人口众多、老龄化明显，医疗资源分布不均和相对缺乏，这些因素都加剧了癌症对民众造成的负担。
目前，大多数癌症的诊断和癌前病变程度的判定主要依靠临床医师的经验和病理诊断。临床医师的经验需要长期临床实践经验的积累，主观性强；病理诊断虽然是金标准，但活检是有创检查，检测的可重复性也受到限制。脱落细胞检测是一种简便、容易为患者所接受的非侵入性检测方法，广泛应用于宫颈、口腔和体腔等各种脏器脱落物的检测。脱落细胞学检查是取病变组织表面脱落细胞或混悬于液体中的细胞制成涂片，染色后进行显微镜检查并做出细胞学诊断。一般情况下，癌组织的代谢比正常组织高，脱屑较正常细胞快，癌细胞彼此间的凝聚力是正常细胞的1/10，故可通过癌细胞脱屑做出细胞学诊断。脱落细胞学检查先用于宫颈癌的早期诊断，之后应用范围逐渐加大，成为诊断早期癌的重要手段。
在传统的脱落细胞学检查中制片方法多为直接涂片，其中标本除受到体液新鲜程度、脱落细胞数量、涂片厚薄均匀度等因素影响外，还因未经加工处理导致背景不清晰，影响诊断，导致漏诊。液基细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）是20世纪90年代出现的细胞学检测方法，现已广泛应用于临床，为宫颈刷片、痰、浆膜腔积液等标本的肿瘤细胞学诊断提供了可靠依据。TCT技术是1996年由美国食品药品监督管理局认证批准并应用于临床，它是一种将脱落细胞保存于液体中，并通过机械、气动和流体力学原理，用自动设备将细胞均匀、分散地涂于载玻片上的一种制片技术。TCT制片法的优越性主要体现在以下几方面：①去除了标本中的黏液、血液等，因而背景较干净；同时，制片过程始终处于液态环境，保存了细胞的完整性；②制片机程序化制片，严格控制涂片的细胞量，细胞均匀分布；③阅片面积小，不易发生视疲劳，减少漏诊；④自动制片减少了污染及人为干扰因素，提高了诊断的准确性与可靠性；⑤能更多地收集标本中的细胞成分，保证涂片中的细胞数量。应用TCT技术制片具有细胞采样量大、标本质量高、涂片薄而均匀、阳性检出率高等特点，是将制片影响减少到低的一种行之有效的方法。
一、传统口腔黏膜脱落细胞学检测
口腔癌具有较高的发病率和死亡率，其中90%以上是鳞状细胞癌。口腔癌预后较差，5年生存率小于50%，甚至经过手术治疗的患者其5年生存率也仅为58.5%。而早期发现的口腔癌，其复发的比例可以减少10%~20%。口腔癌前病变或癌前状态，如口腔白斑、红斑、口腔黏膜下纤维化等已被证实有较高的转化为口腔癌的概率。口腔癌早期无自觉症状，可以无恶性表现，使得口腔检查结果不可靠。
口腔黏膜具有更新快、易脱落的特点，在刷牙等外力作用下口腔黏膜细胞可以脱落到载体刷毛上。一般情况下，可以通过癌细胞脱屑做出细胞学诊断。然而，此方法也有一定的局限性，如异常值的出现、假阳性结果等。因此，应重复进行脱落细胞学检查，采用一套标准化的程序进行检测，包括刷取确切部位的样本，掌握福尔根染色（Feulgen staining）技术以及的图像采集。近年来，不断发展的新技术已应用于口腔癌的脱落细胞学诊断中。
二、口腔黏膜脱落细胞学的定性和定量分析

1．DNA指数（DNA index，DI）值的定性分析：

正常人体的各种体细胞DNA含量是恒定的，大多为二倍体，而肿瘤细胞会出现较多的非二倍体细胞。福尔根反应（Feulgen reaction）可以显示DNA，显色的强度与DNA含量相关。显色强度可用分光光度仪、数字图像分析仪等计算DI值。加拿大BC省肿瘤中心（BC Cancer Agency，BCCA）的诊断标准：①样本中DI值>2.3的细胞为异倍体细胞，出现5个及以上异倍体细胞；②10%的异常增生细胞；③出现异倍体峰。以上3条满足1条即为阳性结果。脱落细胞学检测联合DNA定量分析已常规用于口腔癌的诊断，据报道其诊断的敏感性和特异性均达到。有研究表明，与组织学诊断相比，细胞学诊断技术和DNA定量分析结合可以提前3年以上预测癌的发生。因此，DNA异倍体可以作为口腔癌发生的早期标志物，提示临床医师该病变需要组织学检查确诊和手术。本课题组在2010至2015年进行脱落细胞DNA定量分析研究，脱落细胞检测技术对口腔癌及癌前病变诊断的敏感性为95.12%，特异性为98.20%。联合VELscope Vx照射诊断的敏感性为，特异性为97.44%。
2．口腔癌变风险指数（oral cancer risk index，OCRI）的定量分析：
对于那些癌前病变的DNA指数判定为"不典型"的病例，既不能将其定义为"阳性"，也不能定义为"阴性"。因此需要对其进行定量分析，计算OCRI，指导临床医师制订治疗方案。本课题组在2013至2015年进行口腔黏膜脱落细胞在口腔白斑癌变风险评估中的应用研究，利用脱落细胞DI值成功建立EdTAR（expert-guided data transformation and reconstruction）数据处理方法，并重建数据，选择支持向量机（support vector machine）统计模型计算OCRI，平均随访时间为46个月，全部低OCRI口腔白斑患者均未发生癌变；其中1例病理结果为口腔白斑伴轻度异常增生的患者OCRI为0.88，经过40个月的随访，同一部位发生癌变，病理结果为口腔鳞状细胞癌中分化。此结果证明脱落细胞学检测方法可用于口腔白斑癌变风险的定量评估，且在临床应用中具有可行性，从方法学上验证了该技术可应用于口腔癌前病变的癌变风险评估。
三、口腔黏膜脱落细胞在分子生物学诊断中的应用
1．人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测：

国际癌症研究机构及美国国家研究所于2011年宣布HPV-16是口咽鳞状细胞癌的独立危险因素。尽管HPV在口咽鳞状细胞癌的发生中起重要作用，但在口腔鳞状细胞癌中的作用尚存在争议。以往研究中，HPV在口腔鳞状细胞癌及口腔癌前病变中的检测率波动较大，且尚无一致结论。这样的波动可能是由样本类型、检测手段及地理位置的差异等原因造成。研究表明，HPV初通过肝素硫酸盐介导附着于上皮细胞，HPV感染基底细胞后，病毒基因大量表达，并在每个细胞中形成10~20个拷贝数的病毒DNA，保持在未分化的基底细胞中，随着基底细胞的分裂，病毒分段进入子细胞，感染病毒的子细胞移入颗粒细胞层分化，装配完的病毒终从表层的细胞中释放出去，这种感染特点使得成熟病毒浓度高的地方是病损表面，因而直接从病损表面采样对于HPV的检测更具敏感性。Lawton等对3种取样方法进行比较后发现，含漱、搔刮比活检方法所获标本的阳性率更高。魏清跃和钱成明在瘤体表面取脱落的瘤体上皮细胞作为标本，HPV的检出率与用瘤体组织作为标本的检出率相比差异无统计学意义。因此，临床上可以用脱落细胞取代瘤体组织，提取细胞DNA并进行分子生物学诊断，在获取标本时不仅更简便快捷，而且还具有无创性，患者容易接受。
2．其他辅助口腔癌早期诊断的分子生物学指标：
细胞分子标志物的改变多发生在癌变早期，分子生物学技术有望成为一项诊断口腔癌的基本技术，这些分子标志可用于早期诊断口腔癌，促进口腔癌的早期诊断、早期治疗并用于流行病学调查。脱落细胞学技术可以快速、简单获取分子生物学诊断所需的DNA标本。目前可应用脱落细胞进行检测的指标：①与细胞增殖相关的标志物，如增殖细胞核抗原、核仁组成区嗜银蛋白、端粒酶等；②与细胞凋亡相关的标志物，如存活蛋白、环氧化物酶2等；③癌变相关基因，如p53基因及其表达产物、ras基因、cmyc癌基因、Rb基因等；④染色体畸变，如微卫星标志及杂合性缺失、DNA含量等。
脱落细胞学检测是一种简便、易被患者接受的非侵入性检测方法。目前，该技术除用于妇科标本外，正逐步扩展到非妇科细胞学检测的各个领域，如食管、胃脱落细胞、口腔黏膜脱落细胞、粪便肠脱落细胞、痰液脱落细胞、尿液与脑脊液脱落细胞。TCT与传统涂片技术相比，可以提高异常细胞的检出率，是检测脱落癌细胞的可靠手段。
口腔黏膜脱落细胞学检测以其无创性、操作简便的取材方式，高敏感性的检测特点，通过DNA定量分析计算DI值，采用多参数分析以及统计学模型构建计算OCRI，实现了对口腔癌及癌前病变的定性、定量分析，适用于口腔病变的人群普查、肿瘤早期诊断和疗效监测等，其对临床相关疾病的诊断和治疗有重要意义。此外，脱落细胞学技术可用于快速、简单地获取分子生物学诊断所需的DNA标本，应用于分子生物学诊断，特别是HPV检测。随着各种新技术的发展以及临床医学与实验医学的紧密结合，必将进一步促进癌症的早期诊断与治疗。
来源：中华口腔医学杂志2017年第52卷第3期