益生菌可通过调节肠道菌群介导不同宏基因组途径产生抗肥胖作用

肥胖在世界范围内日益流行，葡萄糖转运体（gluts，主要是glut1和glut4）是脂肪特异性甘油三酯储存的重要决定因素，与肥胖有关。益生菌是活的微生物，当摄入足够时，对人类产生有益作用，部分益生菌具有降血糖和抗肥胖作用，可调节glut介导的葡萄糖摄取。

干酪乳酪杆菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，LCZ）先前被证实对摄入高热量的大鼠可以降低血脂和防止血糖受损,然而肠道微生物群如何调控glut1及葡萄糖摄取活性的机制尚未阐明。   

本实验旨在研究肠道绒毛特异性glut1在肥胖中的作用，以及在没有肠道绒毛特异性glut1表达的情况下，LCZ干预的抗肥胖作用机制，比较了高脂饮食喂养的绒毛特异性glut1敲除（KO）小鼠和经过或不经过LCZ干预对照组小鼠（glut1 flox/flox）之间的体重、肠道菌群扰动、脂肪质量积累和葡萄糖耐量（通过口服葡萄糖耐量试验），并通过宏基因组测序来评价肠道微生物群。结果显示，与对照组小鼠相比，绒毛特异性glut1 KO小鼠在中期前期有更多的脂肪沉积，糖耐量受损，肠道微生物群有明显的改变。益生菌降低了KO型和对照组小鼠的体重、肠系膜和肾周白色脂肪组织（WAT）的重量，并调节其肠道微生物群。结果表明消除肠道上皮细胞glut1的活性会影响肠道菌群、脂肪积累和葡萄糖耐量，使用LCZ可减少脂肪积累和中心性肥胖。    

实验设计

所有小鼠（8周龄）均被喂食高脂饮食（脂肪60%千卡，碳水化合物20%千卡，蛋白质20%千卡），共有5组小鼠，LCZ干预组的小鼠每日灌胃4x109CFU活菌，其他两组每日注射等量的生理盐水。所有小鼠在第21周被处死，收集合并附睾、肾周和肠系膜的白色脂肪组织（WAT）并进行称重。小鼠肠系膜脂肪样本均在4%多聚甲醛中固定48h，用乙醇和二甲苯梯度脱水后，将组织包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木精和伊红对石蜡切片染色，然后进行光学显微镜检查。为了进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），葡萄糖灌胃剂量为每公斤体重2g，在灌胃前（空腹12h）和灌胃后15、30、45、60、90、120min采用Accu血糖监测仪检测小鼠血糖水平。使用商业试剂盒从小鼠尾巴中提取基因组DNA，采用引物对2.85F/2.9R和creF/creR进行PCR检测，确定动物glut1基因型。使用QIAamp DNA stool mini kits 从粪便（所有五个组）和小肠内容物（2个KO小鼠组）中提取细菌总DNA。使用超过1μg的高质量DNA 和NEBNext ultra DNA文库制备试剂盒构建DNA文库。构建的测序文库用索引码进行标记，文库的制备工作在Illumina HiSeq平台上进行测序。对于GV和GVP中的小肠菌群，使用PacBio RSII仪器对16S rRNA基因进行测序，并根据之前的研究进行分析。

前言

肥胖是各种代谢性疾病的主要危险因素，包括代谢综合征和Ⅱ型糖尿病。世界上超过一半的人口超重，中心性肥胖比一般肥胖具有更高的代谢紊乱和冠心病的风险，其特点是腹腔内脏（网膜和肠系膜）堆积，而对中心性肥胖的评估是基于腰围、腰臀比和体重指数。肠系膜脂肪厚度是代谢综合征所有组成部分的独立决定因素，被认为是脂肪肝、代谢综合征和多囊卵巢综合征的指标。与皮下和腹膜前脂肪厚度相比，肠系膜脂肪厚度与心血管危险因素也表现出更强的相关性。在动物研究中发现高脂肪饮食可诱导肠系膜脂肪的积累，因此肠系膜脂肪是导致肥胖发展和并发症的主要原因。 

葡萄糖是在甘油三酯（TG）中构建甘油酯-甘油主干所必需的。葡萄糖从肠道和其他组织摄取脂肪细胞的速率影响TG积累，很明显肠系膜脂肪与肠道紧密相连。葡萄糖转运体（glut1）损伤被认为是脂肪积累和葡萄糖耐量的一种机制，glut1在体内具有多种生理功能，包括维持全身的葡萄糖稳态，特别是在大脑、肌肉、脂肪、肠道和神经元系统中。首先，大脑葡萄糖转运受损多见于glut1缺乏症的儿童，而glut1活动的缺乏会导致癫痫、运动异常、认知障碍等疾病。其次，在癌症病例中glut1的表达在癌细胞中被高度激活，将葡萄糖大量输入细胞，以应对由于生长异常而导致的高局部能量需求。第三，glut1转运体的高表达与葡萄糖水平降低相关，提示其在葡萄糖转运中具有重要意义，这些观察结果表明，glut1可能是导致肥胖及其相关因素的一个重要靶点。

尽管越来越多的证据表明葡萄糖摄取和肥胖之间存在密切联系，但很少有研究确定肠道微生物群在调节glut1中的作用，以及它们在导致肥胖中的交互作用。本研究旨在探讨肠道特异性glut1的表达是否对肥胖有任何影响，以及这种机制是否是通过肠道微生物群的调节。此外，这项研究还旨在寻找促进高脂肪诱导的肥胖关键微生物。通过对微生物宏基因组组成和途径的分析，探讨了干酪乳酪杆菌Zhang对肠道黏膜表面脂肪分布的有益影响。

实验结果

HFD喂养的绒毛特异性glut1 KO小鼠的体重大于对照组小鼠（GV vs GF，P<0.05；），而两组的体重在第18周后变得（P>0.05；）。经过13周的饮食干预后，接受LCZ处理的预防组或治疗组的小鼠比未接受小鼠体重低，这种趋势一直持续到实验结束（GFP和GFT，P<0.001；）。喂食LCZ和HFD的glut1 CKO小鼠的体重也明显低于只喂食HFD的glut1 CKO小鼠（GVP vs GV，P<0.001；）。LCZ预防组的glut1 fl/fl小鼠（GFP）相比非治疗组（GFT）在OGTT 30min时血糖水平下降（；P<0.05）。与glut1 fl/fl小鼠相比，OGTT中绒毛特异性glut1 KO小鼠在30min时显示血糖水平急剧升高（P<0.05；）。然而LCZ并不能纠正LCZ治疗组glut1 CKO小鼠的血糖耐量异常（P>0.05；）。 

为了确定LCZ摄入是否减少不同部位的白色脂肪积累量，在第21周时对小鼠的脂肪组织、附睾、肾周和肠系膜脂肪称重。在LCZ处理的两种小鼠中，除eWAT之外，pWAT和mWAT的重量都降低（P<0.05或P<0.001）。与HFD-glut1 CKO小鼠相比，HFD-glut1 fl/fl小鼠肾周脂肪的重量减少，而肠系膜脂肪的重量没有变化。此外，在LCZ处理的两种类型的小鼠中，mWAT的脂肪细胞大小均减小（3E；P<0.001）。

与LCZ处理组相比，HFD喂养的对照组小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠的Firmicutes/Bacteroidetes比值降低（P<0.01），在属水平上，HFD喂养的glut1 CKO小鼠和glut1 fl/fl小鼠的Bacteroides 相对丰度降低，而该属通过LCZ干预富集。Ruminococcus在HFD喂养的glut1 CKO小鼠中大大减少，但在glut1 fl/fl小鼠中被富集，并且通过LCZ处理促进。

主坐标分析表明，去除绒毛特异性glut1的表达对肠道菌群有深远影响。LCZ处理调节了肠道菌群，绒毛特异性glut1 KO小鼠表现出比对照组小鼠更高的细菌多样性（P<0.001），但在经过和不经过LCZ处理的小组之间没有发现差异。

喂养的野生型小鼠与绒毛特异性glut1 KO小鼠之间肠道物种的相关网络采用Spearman相关分析。黄色实心/灰色虚线边分别表示Spearman秩相关系数为>0.5和<−0.5。边的宽度代表相关性的强度（边缘越宽，相关性越强）。  

在glut1 CKO小鼠和使用或不使用LCZ的对照组小鼠中发现了20个差异丰富的KEGG通路，而给HFD-glut1 CKO小鼠注射LCZ会耗尽肠道微生物组中的这20个KEGG通路（与glut1 CKO小鼠相比），这表明摄入LCZ可能会降低大量微生物酶的功能。这些KEGG通路主要与辅助因子和维生素生物合成、脂肪酸代谢、ATP合成、代谢能力和碳固定参与能量代谢有关，与未接受益生菌的glut1 fl/fl小鼠相比，给予LCZ的glut1 fl/fl小鼠微生物组中富集（GFP vs GF）。与HFD-glut1 fl/fl小鼠相比，HFD-glut1 CKO小鼠中15个KEGG通路的基因丰度富集，表明glut1基因影响微生物酶功能，而不是与葡萄糖转运相关的影响，由于抑制宿主肠道glut1的表达，属于磷酸盐和氨基酸转运系统的糖、多元醇和脂质转运系统的KEGG通路在glut1 CKO小鼠微生物组中富集，因此LCZ的摄入似乎调节了这两种KEGG通路。

讨论

本研究采用条件敲除小鼠模型，研究了肠道特异性glut1、肠道微生物群和中心性肥胖之间的关系，发现益生菌株LCZ通过有益调节肠道微生物群，降低了野生型小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠的肥胖（特别是通过调节不同的肾周脂肪沉积）。 与LCZ类似，给予Lactobacillus plantarum HAC01可减少小鼠的肠系膜脂肪沉积，HFD可诱导肠系膜脂肪中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平升高，而肾周脂肪和附睾脂肪水平不升高，因此肠系膜脂肪被认为是炎症性脂肪，有助于增加肠道通透性、微生物群的改变和全身炎症，肾周脂肪过多可导致脂肪毒性和肾脏损伤。

另一项研究发现，益生菌菌株Bacillus subtilis SJLH001可以降低肾周脂肪和pWAT肌酐水平，与减轻肾小球扩张有关，因此LCZ介导的肾周脂肪减少可能是对HFD诱导的肾脏损伤有保护作用。

数据显示LCZ不仅阻止了HFD喂养小鼠肠系膜和肾周脂肪的积累，而且还减少了glut1缺陷高血糖小鼠肠系膜和肾周脂肪的沉积。因此研究在糖尿病患者中是否存在类似的降脂作用和机制是很有意义的。 glut1介导葡萄糖进入大脑，它是一种血脑屏障必需的蛋白质，促进从血液循环中吸收葡萄糖，然而肠道绒毛glut1在介导肥胖中葡萄糖转运中的作用尚不清楚。证据表明肠道通透性的增加和Ⅱ型糖尿病与肥胖密切相关，其特征是肠道微生物群的改变和炎症性。

此外已知肠道通透性的增加会造成肥胖中脂肪积累和胰岛素抵抗，与glut1 fl/fl小鼠相比，glut1 CKO小鼠有更高的初始体重、快速的脂肪积累和OGTT在30min时血糖水平的急剧升高，表明肠道绒毛葡萄糖转运的损伤可能影响肠道通透性，这种影响通过调节肠道微生物群发挥作用，而肠道绒毛glut1 CKO小鼠的肠道微生物群组成与glut1 fl/fl小鼠有很大的不同。 肠道微生物群在人类和动物的能量获取与肥胖中都起着致病作用，其改变影响肠道通透性，从而诱导产生慢性炎症。研究观察到HFD喂养的glut1 CKO小鼠和HFD喂养的glut1 fl/fl小鼠肠道微生物组存在差异。

先前的研究发现，炎症小体缺乏小鼠中Barnesiella intestinihominis多于对照组小鼠，且与肝脏脂肪变性加重相关。此外在用空腹诱导的高血糖小鼠粪便移植的小鼠中，B. intestinihominis是导致HFD诱导的脂肪性肝炎的关键肠道微生物，在glut1 CKO小鼠中，B. intestinihominis与WAT快速增加之间存在相关性，而LCZ干预降低了肠道B. intestinihominis的相对丰度，从而降低了glut1 CKO小鼠中mWAT和pWAT的重量。Faecalibaculum rodentium是glut1 CKO小鼠中的另一种富集微生物，虽然是SCFA产生者并且能发挥抗癌作用，但微生物的SCFAs可能为宿主提供额外的能量促进肥胖。 肠道中低比例的Firmicutes/Bacteroidetes通常被认为是人类和动物肥胖的生物标志物，益生菌LCZ干预增加了HFD喂养的glut1 CKO小鼠和