质谱鉴定的胰腺导管腺癌天然表位的工程化TCR-T细胞治疗

肿瘤抗原是T细胞治疗诱导肿瘤特异性排斥反应的重要靶点。然而，识别胰腺导管腺癌(PDAC)特异性T细胞表位一直具有挑战性。使用先进的质谱(MS)分析，确定癌症相关的I类MHC结合表位，这些表位由具有不同HLA-A类型的多个PDAC患者共享。在这里，研究了其中一个表位LAMC2 203-211，它是LAMC2蛋白上天然存在的非突变表位。在LAMC2 203-211肽刺激下，克隆了TCR，并用慢病毒载体将其导入Jurkat人T细胞系。发现表达LAMC2 203-211特异性TCR的Jurkat细胞在体外对PDAC细胞具有强大的LAMC2特异性细胞毒作用。此外，在皮下或原位植入的肿瘤来源于HLA-A等位基因匹配和不匹配的PDAC患者的小鼠中，在输注LAMC2靶向T细胞后，肿瘤生长以LAMC2依赖的方式受到抑制。因此，开发了一种基于LAMC2特异性TCR的T细胞治疗策略，可能适用于许多PDAC患者。这是首采用MS分析来确定PDAC中可能作为PDAC免疫治疗靶点的天然CD8+T细胞表位的研究。

胰腺导管腺癌(PDAC)是全球第四大癌症相关死亡原因，由于其易侵袭和转移，其5年生存率仍然很低。缺乏有效的治疗替代方案和对传统疗法的抗拒导致了较差的结果。因此，过继转移可在体外激活的选定抗原特异性T细胞可能满足改善PDAC患者治疗结果的这一未满足的需求。

在临床前小鼠研究中，间皮素(MSLN)（一种在PDAC组织中高表达的蛋白）的CAR T细胞能够减轻肿瘤负担并延长生存期。然而，临床试验表明，使用MSLN靶向CAR T细胞的治疗效果有限，对PDAC患者的总体生存几乎没有改善，可能是由于CAR T细胞无法渗入促结缔组织肿瘤、CAR T细胞耗尽以及癌症相关成纤维细胞介导的免疫抑制。靶向其他PDAC抗原的CAR T细胞，如CD133、EGFR和HER2，也已在早期临床试验中进行了测试，但显示出有限的疗效。

与通过嵌合B细胞受体结合抗原的CAR T细胞不同，TCR-T细胞疗法使用TCR结合HLA来识别肿瘤细胞表面表达的T细胞抗原或肿瘤细胞呈递的表位。通过这种方式，靶标的范围可以扩大到包括细胞质和核蛋白。研究表明，表达来自MSLN的TCR靶向特定多肽的工程小鼠T细胞可以渗透到基因工程KPC小鼠体内自发形成的促结缔组织瘤。使用单次自体T细胞输注治疗一名进行性转移性PDAC患者，这些自体T细胞经过基因改造以靶向突变的KRAS G12D HLA-C结合表位。对先前标准化疗无效的患者获得了72%的部分缓解。然而，这样的患者候选人非常罕见。

开发PDAC免疫疗法的一个重大挑战是获得更多关于PDAC中免疫优势抗原信息，以及识别免疫优势抗原的适当技术方法。此外，由于癌症免疫编辑的现象，必须针对多个肿瘤抗原来防止肿瘤免疫逃避。因此，鉴定大量的免疫原性PDAC抗原为未来基于表位的PDAC免疫治疗的发展奠定基础是至关重要的。

这里鉴定了多个不同HLA的PDAC患者共有的T细胞表位，并证明鉴定出的表位结合不匹配的HLA分子，并在非HLA型相合患者的外周T细胞中诱导了T细胞反应。这个候选T细胞表位包括属于层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)的一个表位，LAMC2是一种上皮基底膜蛋白。先前的研究表明，通过体外T2结合试验，该LAMC2表位可以很强地结合HLA-A2和HLA-A3分子。有趣的是，LAMC2与胰腺癌和肺癌患者不良的生存结局相关。此外，先前的研究表明，LAMC2有助于肿瘤的侵袭、生长、迁移和各种癌症的转移，使其成为开发癌症治疗的潜在靶点。这里，描述了针对肿瘤相关T细胞表位LAMC2 203-211的特异性TCR在LAMC2上的克隆，并证明了这种TCR在体外和体内的抗肿瘤活性。

材料和方法

细胞系

人PDAC细胞系(HPDE，Panc-1，AsPC-1)和人T细胞系Jurkat。Panc6.03、Panc10.05、Panc9.05和Panc7.078是根据约翰霍普金斯医疗机构审查委员会(JHMI IRB)批准的方案从手术切除的PDAC标本中建立的原发胰腺癌细胞系，并通过DNA和基因表达谱进行认证。

使用LAMC2 203-211肽进行T细胞培养

按JHMI IRB批准的方法收集存档的PBMC，以每孔5×10^6细胞密度接种于24孔板中，用LAMC2 203-211肽(10μg/ml)和IL-7 (20ng/ml)刺激。第3天加入小剂量rIL-2 (20U/ml)。每3天用添加rIL-2(20U/ml)和IL-7(20 ng/ml)的新鲜培养基更换一半的培养基。在存在细胞因子而没有多肽的情况下培养的PBMC被用来提供基线TCR库以供比较。21天后，使用人CD8+T细胞分离试剂盒，通过磁激活细胞分选(MACS)对CD8+T细胞进行分选，并按照10x Genomics Chromium单细胞方案进行处理。然后使用10x Chromium平台进行单细胞TCR测序。

LAMC2 203-211多肽刺激后高扩增的TCR克隆如下：

Jurkat细胞中TCR重建

采用OBiO技术合成慢病毒转移载体。TCR1和TCR2的α-链和β-链的可变区与P2A多肽元件相连，形成转基因盒5‘-TCRβ-P2A-TCRα-3’。合成转基因小盒，并将其整合到GFP标记的逆转录病毒载体GL121中。P2A连接肽可提高人TCR的表达和功能。为了增加TCR表面的表达，两个TCR链基因的恒定区被小鼠恒定区取代。

将携带TCR1和TCR2的慢病毒转移载体与包装载体pCMV-dR8.91和包膜载体pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞，获得慢病毒颗粒。添加Lipofectamine 2000转染剂。分别于48h和72h收集含有相应慢病毒颗粒的培养上清。

为了建立表达TCR1、TCR2和GL121骨架慢病毒感染细胞系(分别为TCR1-Jurkat、TCR2-Jurkat和GL121-Jurkat)，在polybrene(1:500)存在下将重组慢病毒分别感染人Jurkat T细胞。感染后24h换成正常培养基。

用shRNA建立稳定的LAMC2敲低细胞

细菌甘油储备液LAMC2-shRNA和对照shRNA。按照上述相同的步骤，将扩增的质粒用于生产慢病毒。为了建立稳定的LAMC2基因敲低的Panc10.05细胞系(LAMC2KD Panc10.05)和相应的对照Panc10.05细胞系(shCtr Panc10.05)，将产生的慢病毒转导至生长到70%融合的Panc10.05细胞。感染后24h换成正常培养基。筛选时，在培养基中加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素。

Jurkat细胞的体外细胞毒性测定

将Panc10.05肿瘤细胞(5×10^3)和转导TCR基因的Jurkat细胞(2.5×10^4)按1:5的比例在肿瘤细胞培养基中于96孔板中培养48h，测定单独培养的Jurkat细胞的基线死亡率。在效靶比为5:1和10:1的条件下测定细胞毒作用，并选择5:1的比例作为佳条件。使用CytoTox-Fluor™细胞毒性测定试剂盒测量细胞死亡。从单独培养的Jurkat细胞的基线死亡率减去共培养细胞的死亡率，计算出肿瘤细胞的死亡率。

小鼠模型及体内抗肿瘤实验

小鼠：雌性NOD/LtSzPrkdc-scid IL2rγ-tm1Wjl (NSG) (6~8周龄)。

皮下模型：将2×10^6的Panc10.05细胞接种于NSG小鼠两侧皮下。3~5周后，摘取皮下肿瘤，切成∼2mm^3的块，植入8~10周龄NSG小鼠皮下。将小鼠随机分为不同的治疗组。3天后，荷瘤的NSG小鼠被随机分配到指定的治疗组。每周经尾静脉注射指定的Jurkat细胞(1×10^6)，并在每次治疗期间同时注射rIL-2(100U)。每周用卡尺测量肿瘤大小两次。肿瘤测量由对小组分配不知情的研究人员进行。用卡尺测量每个肿瘤的长(L)轴和短(S)轴。肿瘤体积(V)计算为V=(L×S^2)/2。

原位模型：JH029和JH072为来源于胰腺导管腺癌患者的PDX。将小块PDX接种到NSG小鼠两侧皮下。5~8周后，取出皮下肿瘤，切成~2mm^3的块，原位植入8~10周龄NSG小鼠胰腺内。8天后，荷瘤的NSG小鼠被随机分配到指定的治疗组。如上述皮下模型，通过尾静脉每周注射一次指定的Jurkat细胞。用Vevo 750小型动物超声系统每周测量肿瘤大小两次。肿瘤体积(V)计算为V=(L×S^2)/2。

PDAC中潜在T细胞抗原的鉴定及LAMC2作为T细胞治疗靶点的选择

使用pan-HLA I类亲和纯化柱从人PDAC组织中分离出HLA I类限制性多肽，并通过质谱多肽组分析鉴定T细胞表位。通过多肽组分析，确定了多个具有独特的HLA-A等位基因的患者所共有的多个T细胞表位。然后，从共享的表位库中选择了6个表位（如下），它们能够在HLA型匹配和不匹配的患者的PBMC中诱导T细胞反应，如IFN-γ和/或颗粒酶B的产生，用于进一步研究。

使用免疫组织化学(IHC)方法，分析了这6种多肽在人PDAC肿瘤和邻近非肿瘤正常组织中的表达(图1A；图S1A)。在两名患者的PDAC组织标本中发现了LAMC2 203-211表位，该表位由LAMC2蛋白的203到211氨基酸组成，其中一名患者携带的是HLA-A2和A3，另一名患者携带的是HLA-A2和A11。发现LAMC2在侵袭性PDAC肿瘤细胞上高表达，但在正常胰腺组织和癌旁组织(包括组织细胞周围的间质细胞)中检测不到；因此，LAMC2是治疗干预的理想靶点。相反，TRAPPC11、ORMDL3和MYL12A在肿瘤组织和癌旁正常组织中均有表达，而ZMYND11和CTNNBIP1在肿瘤组织和癌旁正常组织中均未检测到。

接下来，评估了LAMC2在各种PDAC细胞系中的表达。发现LAMC2在正常胰腺导管上皮细胞系HPDE中低表达，而在大多数PDAC细胞系中高表达。来自癌症基因组图谱(TCGA)的数据分析也显示，与正常胰腺组织相比，