肝细胞癌组织芯片环氧合酶-2表达的半定量图像分析

【摘要】  目的 分析环氧合酶-2(COX-2)在肝细胞癌(HCC)中的表达及意义。 方法 应用改良的手工制备组织芯片方法制备含150例肝细胞癌、92例癌旁肝硬化、45例癌旁慢性肝炎以及37例肝内转移灶和13例正常肝组织的组织芯片,结合免疫组织化学染色和图像分析技术检测COX-2蛋白的相对表达量。 结果 COX-2蛋白在HCC表达显著低于癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎(P<0.01)，但高于正常肝组织(P<0.05),差别具有统计学意义。在HCC组织中,低分化HCC的COX-2表达量显著低于高分化的HCC,差别有统计学意义(P<0.01)。COX-2蛋白的表达与性别、肿瘤大小、组织学类型、包膜侵犯及转移均无关(P>0.05)。 结论 COX-2在HCC的发生中发挥重要作用,并与HCC的分化程度密切相关,但与HCC进展及侵袭转移关系不大。

【关键词】  前列腺素内过氧化物合酶; 肝肿瘤; 癌,肝细胞; 芯片分析技术; 免疫组织化学; 图像处理,计算机辅助

    Semi-Quantitative Image Analysis of Cyclooxygenase-2 ex[x]pression

    in Hepatocellular Carcinoma by Tissue Chips

    ZANG Shengbing1, HUANG Aimin1, LIU Jingfeng2, ZHENG Zhihua1 , GAO Lingyun1, GAO Meiqin1

    1.Division of Pathology, Institute of Oncology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

    2.Department of Hepatology, The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

    ABSTRACT:  ob[x]jective  To detect the ex[x]pression of cyclooxygenase-2(COX-2) in hepatocellular carcinoma(HCC).  Methods  Tissue chips were constructed by modified manual tools, which contained 150 HCC samples, 92 cirrhotic livers adjacent to HCC samples, 45 chronic hepatitis livers adjacent to HCC samples, 13 normal liver tissue samples and 37 intrahepatic me[x]tastasis lesion samples.  The ex[x]pression of COX-2 was determined by immunohistochemistry and semi-quantitative image analysis.  Results  The ex[x]pression of COX-2 in HCC was lower than that in cirrhotic liver adjacent to HCC tissue or chronic hepatitis tissue, but higher than that in normal liver tissues(P<0.01).  More lower differentiation of HCC more the ex[x]pression of COX-2 decreased. COX-2 ex[x]pression was not correlated with sex, age, tumor size, histological type, tumor invasion and me[x]tastasis(P>0.05).  Conclusion  COX-2 might play an important role in the process of HCC tumor genesis and the differentiation of HCC, but not related with invasion and me[x]tastasis.

    KEY WORDS:  prostaglandin-endoperoxide synthase; liver neoplasm; carcinoma,hepatocellular; microchip analytieal procedures; immunohistochemistry; image processing,computer-assisted

    计算机图像处理系统的诞生是计算机技术与形态影像为主的学科相结合的结果,使得定量病理学得到长足发展。目前,彩色图像分析系统已较广泛应用于免疫组织化学结果的分析中［1］。福建省是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)高发的省份。笔者应用组织芯片和图像分析技术检测环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在HCC的表达情况,探讨其与各临床病理参数的关系及意义。

    1  材料与方法

    1.1  对象  收集福建医科大学附属医院2000—2006年手术切除的HCC标本150例,癌旁肝硬化92例,癌旁慢性肝炎45例,肝内转移灶(卫星灶和门静脉癌栓)37例。所有病例均经病理诊断证实,术前均未进行化疗及放疗。HCC病例按Edmondson组织学分级法分为Ⅰ～Ⅳ级：Ⅰ～Ⅱ级为高分化,Ⅲ～Ⅳ级为低分化;并判断有无包膜侵犯以及肝内外转移等情况,病理参数见表1。另收集13例正常肝组织。所有标本经10％福尔马林固定,常规石蜡包埋备用。

    1.2  主要试剂  兔抗人COX-2浓缩型多克隆抗体(美国Cayman公司,美国University of Texas-Houston Health Science Center Ruan KH实验室惠赠); ElivisionTM plus二步法试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。

    1.3  方法

    1.3.1  肝细胞癌组织芯片制备  应用改良的手工制备组织芯片的方法制备含肝细胞癌、癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎以及肝内转移灶和正常肝组织的组织芯片［3］,其基本过程包括用特制的模具定位、打孔针在受体蜡块打孔、取样针在供体蜡块取样及按预先设计的顺序准确点样。以4 μm连续切片,温水裱片,敷贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片。取其中一张行HE染色供形态学观察。

    1.3.2  免疫组织化学染色  高压抗原修复,采用ElivisionTM plus二步法,据试剂说明书操作,一抗COX-2工作浓度为1∶100,以PBS代替一抗作为阴性对照,DAB显色,苏木精对比染色。

    1.3.3  结果判断  COX-2蛋白定位于细胞胞质,阳性产物为棕黄色。

    1.3.4  图像分析  采用摄像生物显微镜(BH-2，日本Olympus公司)在400倍视野下对芯片上每个点的阳性区域拍照,每例标本取5个视野;应用彩色图像分析系统(Image-Pro Plus 5.0,美国Media Cybernetics公司)以显微镜定标尺定标,光密度校正,在HIS颜色模式下选中阳性区域,挖除核染色,并转换为灰度图,使背景填充白色,测定每个视野的积分光密度(integral optical denisity,IOD)值,传入excel表中,取平均值代表标本蛋白的相对量,以进行半定量分析;第1张图处理完毕将整个分析过程录制成宏程序,后续分析图像,按照宏程序自动分析完成。

    1.4  统计学处理  所得计量数据以x±s表示,采用SPSS 11.5统计软件包对数据进行单因素方差及t检验分析,以P<0.05为差别具有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  COX-2在HCC等4种组织的定性表达  COX-2蛋白阳性信号定位于细胞质,在高分化HCC中癌细胞为弥漫性阳性,在低分化HCC及肝内转移灶中弱表达或不表达,在癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎组织中表现为局灶肝细胞阳性,在正常肝组织无表达或微弱表达(图1)。

    2.2  COX-2在HCC等4种组织的半定量表达  COX-2蛋白在HCC组、癌旁肝硬化(肝硬化组)、癌旁慢性肝炎(肝炎组)以及正常肝组织(正常组)相对表达量分别为(×103):(1.21±1.34),(3.38±1.46),(3.01±1.29),(0.21±0.33);COX-2蛋白在HCC组表达显著低于硬化组、肝炎组(P<0.01),但高于正常组(P<0.05),差别有统计学意义(图2)。

    2.3  COX-2在HCC中的表达与HCC临床病理学参数的关系  COX-2蛋白在HCC中表达情况见表1。低分化HCC的COX-2表达量显著低于高分化的HCC,差别有统计学意义(P<0.01)。COX-2蛋白在37例HCC原发灶及其相应的肝内转移灶中的相对表达量无明显差别(P>0.05)。COX-2蛋白的表达与性别、肿瘤大小、组织学类型、转移无关(P>0.05)。

    3  讨  论

    COX-2是一种诱导型环氧合酶,静息时不表达,当受到生长因子、丝裂原等多种因素诱导时,表达上调,其活性可增加数十倍［4］。大量研究表明COX-2不仅是炎症反应的重要环节,而且在胃癌、结肠癌等大多数恶性肿瘤中呈高表达,并与恶性肿瘤的形成及发展密切相关［5-6］。

    COX-2与HCC的关系一直是近年来研究的热点,但COX-2在HCC中表达的情况报道尚不一致。Callejas、朱道奇等发现COX-2在HCC呈高表达,与HCC进展及侵袭转移密切相关［7-8］。而Koga、Morinaga等发现COX-2在癌旁组织表达明显高于HCC,在高分化HCC中表达明显高于低分化HCC,提示COX-2可能参与HCC发生的早期阶段,并与HCC分化密切相关［9-10］。本研究利用含150例HCC的组织芯片,结合免疫组织化学及彩色图像分析技术,研究结果显示COX-2在HCC中表达明显升高,但随着癌细胞分化程度降低,COX-2蛋白相对表达量明显下降,且COX-2的表达与HCC患者年龄、肿瘤大小、组织学类型、包膜侵犯以及转移均无关,提示COX-2在HCC的发生中发挥表1  COX-2蛋白在肝细胞癌的表达与临床病理学参数的关系重要作用,并与HCC的分化程度密切相关,这与Koga、Morinaga等的报道是一致的［9-10］。本研究还发现COX-2在HCC原发灶和转移灶中表达无明显差别,推测COX-2与HCC侵袭转移及预后关系较小。

    研究发现在肝细胞癌发生的早期阶段其病理学分级一般为高分化,随着病情的进展,HCC分化程度向中、低分化方向发展,在转移灶中HCC分化程度比原发灶更低［11-12］。本研究结果提示COX-2参与了HCC发生的早期阶段,这对探讨多阶段、多步骤形成HCC机制有一定的意义。

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［10］ Morinaga S,Yamamoto Y,Noguchi Y,et al. Cyclooxygenase-2 mRNA is up-regulated in cirrhotic or chronic hepatitis liver adjacent to hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2002,17(10):1110-1116.

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［12］ Nakashima O,Kojiro M. Recurrence of hepatocellular carcinoma:multicentric occurrence or intrahepatic me[x]tastasis? A viewpoint in terms of pathology［J］. J Hepatobil Pancreat Surg, 2001,8(5):404-409.

作者：臧盛兵 黄爱民,刘景丰, 郑智华, 高凌云 高美钦

作者单位：福建医科大学 1.基础医学院病理学系,福建医科大学肿瘤研究室,福州 350004; 2.附属医院肝脏外科,福州 350005