实验性自身免疫性脑脊髓炎的视神经病理改变

作者：朱潇颖，赵永波，刘文文，凌振芬

作者单位：200080上海交通大学附属人民医院神经科

摘要】  　　目的 研究实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的视神经病理改变。方法 足垫皮下注射豚鼠脊髓匀浆和完全弗氏佐剂（CFA）混合物制作Wistar大鼠EAE模型，于发病后第6 d将大鼠处死，取视神经、脑和脊髓，行HE和LFB染色，光镜和电镜下观察其病理改变。结果 病理检查发现EAE模型组大鼠脑、脊髓有不同程度的炎症反应和脱髓鞘改变;均有视神经病变，光镜主要表现为炎症反应和脱髓鞘，视神经髓鞘脱失重于炎症反应；电镜主要表现为髓鞘稀疏，少突胶质细胞数量减少、胞核固缩，其周围包裹的髓鞘板层松解，轴突髓鞘分离。 结论 EAE大鼠存在明显的视神经病变，主要为视神经炎症反应和脱髓鞘改变。

【关键词】  实验性自身免疫性脑脊髓炎 视神经 脱髓鞘

　　Pathological changes of optic nerves in experimental autoimmune encephalomyelitis 

　　ZHU Xiaoying, ZHAO Yongbo, LIU Wenwen, et al.

　　Department of Neurology, the First Peoples Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China
   
　　Abstract：ob[x]jective  To explore pathological changes of optic nerve  in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods  Established the Wistar rat models of EAE by footpad injection of guinea pig spinal cord homogenates and CFA. Animals were executed 6 days after disease onset, and optic nerves, brains and spinal cords were removed for light (HE staining and LFB staining) and electron microscope pathological analysis. Results  Various degrees of inflammation and demyelination of brains and spinal cords were found in the rats of EAE group. All the EAE rats had optic neuropathy mainly manifested as inflammation and demyelination under light microscope. Demyelination changes were more apparente than inflammation in optic nerves. Electron microscope observes decreased number of myelin sheaths and Oligodendrocytes (OLGs), OLGs karyopycnosis and the loosed myelin sheaths and their disassociation from axons were also found nearby. Conclusions  Optic neuropathy is obvious in this rat model of EAE, mainly manifested as optic inflammation and demyelination.
   
　　Key words：experimental autoimmune encephalomyelitis; optic nerve;demyelination

　　实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类中枢神经系统（CNS）炎症性脱髓鞘疾病的常用动物模型。关于EAE动物模型的视神经病变的系统研究较少，国内尚未见报道。本研究通过光镜和电镜观察EAE模型大鼠视神经的病理改变，为进一步研究CNS脱髓鞘疾病合并的视神经病变提供病理资料。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  雌性Wistar大鼠20只，质量(200±20)g，SPF级；随机分为对照组和EAE模型组。豚鼠5只，雌雄不限，质量350～400 g，普通级。实验动物均由上海市人民医院动物房提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  EAE模型制作  取豚鼠新鲜脊髓加完全弗氏佐剂（CFA, Sigma公司）充分乳化后按0.5 ml/只,大鼠脚垫皮下注射，同时及48 h后给大鼠足背皮下注射(0.2 ml/只)百日咳杆菌（1×1010个/ml，上海生物制品研究所）。对照组大鼠同时注射等量生理盐水加CFA及百日咳杆菌。注射部位皮肤常规消毒。注射豚鼠脊髓匀浆＋CFA当天记为免疫后第0 d。

　　1.2.2  临床评分  大鼠免疫后每日由两名观察者盲法观察大鼠一般情况,称重及临床评分。临床评分采用常见的5分评定法［1］，0分：无异常；1分：尾巴失去活动与挺立功能；2分：后肢无力；3分：后肢瘫痪；4分：四肢瘫痪；5分：死亡。

　　1.2.3  病理学观察  EAE模型组大鼠于发病后第6 d（发病当日为第0 d）取材，其余大鼠（包括未发病的EAE模型组大鼠和对照组大鼠）在免疫后第24 d取材。用10％水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，行心脏灌注（先生理盐水，后4％多聚甲醛）后取出大鼠脑、脊髓、视神经、坐骨神经等放入4％多聚甲醛中固定；常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片,HE和LFB焦油紫髓鞘染色，光镜下观察。并随机选择发病的EAE模型组大鼠和对照组大鼠各1只，取其视神经近中枢段约1 mm3组织，立即投入2.5%戊二醛中固定，按常规电镜技术制备半薄切片和超薄切片电镜下观察。

　　2  结果

　　2.1  临床评分  对照组大鼠无发病。EAE模型组大鼠9只（分别在免疫后第10～18 d）发病（90％），平均（13.9±2.6）d发病；临床评分1～4分，平均（2.0±1.4）分；1只未发病，临床评分为0分，无任何异常表现。

　　2.2  脑、脊髓病理改变  见图1。对照组大鼠脑、脊髓组织病理学检查未见异常。EAE模型组大鼠脑、脊髓的主要病理学表现为炎性细胞浸润和髓鞘脱失。HE染色见脊髓灰白质交界处、灰质、白质、脊膜、前正中裂、中央管周围、后正中沟炎性细胞浸润，以灰白质交接处为明显。炎性浸润在血管周围形成“轴套”，在脑、脊髓实质内也有炎性细胞浸润。脊髓、脑干炎症表现程度明显重于大脑和小脑。大脑和小脑的炎症反应主要位于脑室周围和脑膜。LFB焦油紫染色示髓鞘脱失位于脊髓、脑干（主要位于近灰质的白质、后索和侧索）和大脑（主要位于白质深部），部分标本脊髓神经根处也有脱髓鞘。大多数脱髓鞘病灶位于炎症反应周围，呈“花环样”围绕血管周围分布，严重者脱髓鞘病灶相互融合呈片状分布，高倍镜下见炎症区域髓鞘大多崩解消失。大鼠组织病理学异常程度基本同临床评分呈正比。另外，周围神经如马尾、坐骨神经和脊神经根的包膜和神经纤维间有单个核细胞的浸润。

　　2.3  视神经病理改变

　　2.3.1  光镜  见图2。EAE模型组9只发病大鼠均出现视神经病理改变，5只大鼠双侧、4只一侧视神经异常。HE染色示双侧视神经包膜和神经束膜见少量炎性细胞浸润，程度较脊髓和脑干轻。LFB染色示明显脱髓鞘改变，主要位于包膜下、近视神经内部区域。病灶处髓鞘稀疏、炎性细胞浸润程度较轻。高倍镜下变性的髓鞘染色深浅不一，因磷脂消失横断面呈半环状或空白；有的脱髓鞘区出现髓鞘再生，再生的髓鞘深染、髓鞘环小、形状多不规则。对照组大鼠和EAE模型组1只未发病大鼠的视神经未见异常。

　　图1  A：对照组大鼠脊髓横断面，无异常(HE×50)；B(HE×50)、C(HE×100)：EAE大鼠见血管周围炎症细胞浸润；D：对照组大鼠脊髓和神经根均未见髓鞘脱失(LFB×50)；E：EAE大鼠延髓见明显炎症反应和脱髓鞘，脱髓鞘范围广泛，病灶边界不清，相互融合(LFB×50)；F：为E的放大，示炎症周围髓鞘崩解，胞浆多为泡沫状，箭头示吞噬细胞内的髓鞘碎片(LFB×400)；G：EAE大鼠炎症及周围轻度脱髓鞘，血管周围呈现“花环”样改变，并见神经后根脱髓鞘，细箭头所指(LFB×100)；H：为一只起病相对较缓的EAE大鼠，脑桥脱髓鞘病灶，边界较清晰，无炎症细胞浸润(LFB×50)；I：EAE大鼠坐骨神经见炎症细胞浸润(HE×400)（略）

　　图2  A：对照组大鼠视神经无异常(LFB×50)； B：EAE大鼠视神经横断面，见脱髓鞘改变，边界较清(LFB×50)； C：EAE大鼠视神经脱髓鞘病变伴髓鞘再生，见小、不规则、深染的再生髓鞘环(LFB×400)； D：EAE大鼠视神经横断面，左侧见相对完整的髓鞘，髓鞘环排列紧密，而右侧为明显脱髓鞘病变，病灶边界清晰，髓鞘崩解，髓鞘环数密度降低(LFB×400)； E：对照组大鼠视神经纵切面无异常(LFB×400)；F：EAE大鼠视神经纵切面见明显脱髓鞘病变(LFB×400)（略）

　　2.3.2  电镜  见图3。对照组大鼠视神经髓鞘排列紧密、整齐，胞核饱满，胞浆丰富，未见脱髓鞘。EAE模型大鼠视神经存在明显病变，病灶内髓鞘肿胀，髓鞘板层松解，轴突髓鞘分离，髓鞘环数密度下降，髓鞘稀疏，完全性和不完全性的髓鞘脱失，伴有髓鞘再生。髓鞘形成细胞少突胶质细胞（OLG）数量明显减少，病灶OLGs胞核呈不同程度固缩，内质网肿胀，胞浆结构松散。同时部分轴突病变，轴突内线粒体肿胀、细胞器消失和微管结构模糊。脱髓鞘区域和正常区域的边界较清晰，病灶内未见明显的炎性细胞浸润。

　　图3  视神经超微结构。A、B：对照组大鼠髓鞘环排列整齐无脱失，OLGs胞核饱满，胞浆丰富(A×4200，B×9700)； C、D：EAE大鼠髓鞘明显稀疏、排列不规则，髓鞘脱失(细黑箭头)，伴有细、小、不规则的再生髓鞘(虚线白箭头)；OLGs数量明显减少，OLGs细胞核固缩(粗黑箭头)，内质网肿胀（白箭头），胞浆结构松散，其周围部分包裹的髓鞘板层松解，轴突髓鞘分离，空泡形成；部分OLGs凋亡(黑箭头)；部分轴突线粒体肿胀，微管结构模糊(C×4200，D×9700)（略）

　　3  讨论
   
　　豚鼠脊髓匀浆诱导的Wistar大鼠EAE模型是国内较成熟的EAE模型，该模型的发病率和稳定性高［2,3］，是研究多发性硬化（MS）有效而经济的动物模型。本实验采用单次免疫，脚垫皮下注射，CFA与百日咳杆菌作为免疫增强剂，提高了大鼠EAE的发病率。病理检查显示EAE大鼠CNS的基本病理表现为炎性反应和髓鞘脱失，同既往研究［4］报道的病理表现基本一致。
   
　　视神经炎与MS、视神经脊髓炎（NMO）之间存在密切的关系，但其发病机制仍不清楚。因此，建立相关动物模型用以进一步研究很有必要。炎症性视神经病变的动物模型包括：（1）以CNS髓鞘抗原免疫诱导的EAE模型；（2）病毒诱导的脱髓鞘模型［4］；（3）抗体诱导的脱髓鞘模型［5］。其中以CNS髓鞘抗原免疫诱导的EAE模型较为常用。Sakuma等［6］发现髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）免疫的各型LewisEAE大鼠，60%存在不同程度的视神经病变。Shao等［7］以MOG或MOG特异T细胞免疫C57BL/6小鼠可诱导出较为严重的视神经炎。Stefferl等［8］以MOG免疫Brown Norway大鼠诱导出仅累及视神经和脊髓的模拟NMO的动物模型，以MOG免疫MOG特异的T细胞受体（TCR）转基因小鼠也可模拟NMO，出现脊髓和视神经的炎症反应和脱髓鞘［9］。国内未有Wistar大鼠及其他EAE动物模型视神经病变的系统研究报道。本研究通过病理学方法发现WistarEAE大鼠存在明显的视神经病变，所有临床发病的WistarEAE大鼠均有视神经病理异常，视神经病变的发病率达到90%，故该模型可用作研究炎症性视神经病变的动物模型。相比其他CNS区域，实验中观察到视神经的髓鞘脱失重于炎症反应。电镜观察发现病灶内OLGs数量明显减少，OLG胞浆肿胀，其周围的髓鞘环板层结构松解，而这种松解在髓鞘内板层似乎更明显，髓鞘板层与轴突分离。这提示OLGs病变引起了继发性的脱髓鞘。病灶内罕见炎性细胞，提示在这类病灶中可能体液免疫起重要作用。今后的研究方向可深入研究脱髓鞘疾病具体的发病机制，如视神经、脊髓等与CNS其他区域局部免疫环境的分析，比较免疫组分侧重、局部抗原加工提呈和血脑屏障特性的差别和不同种系遗传差别等。

【参考文献】
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　　［8］Stefferl A, Brehm U, Storch M, et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein induces experimental autoimmune encephalomyelitis in the ‘resistant’ Brown Norway rat: disease susceptibility is determined by MHC and MHCli[x]nked effects on the B cell response［Ｊ］. J Immunol, 1999, 163: 40.

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