辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异分析

作者：吴少慧，何雅慧，于伟，张眉眉，崔健秋，刘敏，付荣华，赵晓光

作者单位：辽宁省疾病预防控制中心传染与感染性性疾病控制所，沈阳 110005

【摘要】  目的 了解2000～2006年辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异特征。方法 利用辽宁省流感监测的咽拭分离株中的甲1亚型流感病毒核酸，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，测序，并推导出其氨基酸序列，进行基因进化特征分析。结果 辽宁省2000～2002年均分离到甲1亚型流感病毒，但消失了近3年后，2005年底又出现，且基因序列碱基发生变异，与2005年以前的病毒株和疫苗株A/New Caledonia/20/1999比较〔1〕，在其HA1蛋白分子上存在有4个氨基酸位点(187位W>R，188位Y>F,209位Q>K,249位V>A)发生了替换。基因序列及氨基酸序列同源性均有下降。结论 辽宁省2000～2006年甲1亚型流感病毒基因序列发生了明显变异，与甲1亚型疫苗株A/New Caledonia/20/1999同源性有下降趋势，提示其抗原可能发生部分漂移或更换，这对流行季节疫苗选择和流行病学研究都具有重要意义。

【关键词】  流感病毒；甲1亚型；序列分析

　　Analysis on characterization of HA1 gene of influenza virus subtype H1N1 in Liaoning province 

　　WU Shaohui,HE Yahui,YU Wei,et al.

　　Liaoning Provincial Center for Disease Control and Prevention(Shenyang 110005,China)

    Abstract： ob[x]jective  To characterize HA1 gene of influenza virus subtype H1N1 circulated from 2000 to 2006 in Liaoning local area.Methods  Viral RNA was extracted and transcribed into cDNA by reverse transc[x]riptase and amplified by PCR.The product of PCR was purified and sequenced by ABI 3100 avant.The sequence data were analyzed with epidemic records.Results  (1)The 21 sequences including those from genbank(except the other earlier 2 sequences) can be roughly divided into two major distinct lineages before and after the year 2000.(2)Four recent Liaoning strain sequences in 2005～2006 have a variation about 3% compared with the other 5 strains of a few years ago.The nucleic acid and amino acid sequence data of HA1 domain showed that there were four important mutant positions,they were 187 W>R,188 Y>F,209 Q>K,249 V>A respectively.Conclusion  The HA1 domain of HA gene of influenza virus(H1N1) isolated from 2005～2006 showed mutation,and the mutated viruses were becoming the dominant circulating strain in Liaoning local area,and showed amino acid sequence difference compared to A/New Caledonia/20/1999,the vaccine components pronounced by WHO from 1999 to 2006,which suggested that further surveillance should be conducted to monitor the virus mutation in circulation.

    Key words： lnfluenza virus;subtype H1N1;sequence analysis

　　引起流感大流行的病原体是流感病毒，共有3个不同的亚型，而其中的甲型流感能引起世界性的大流行〔1〕。辽宁省作为第2批WHO流感网络实验室，自2000年初至今已分离鉴定了近300株地方流感病毒，其中甲1亚型为115株〔2〕，我们随机选取了9株不同年份的H1N1辽宁株，测定其HA1基因序列，并与美国国立卫生研究院(GenBank)基因序列数据库〔3〕中已发现的14个序列进行比较，以了解2000～2006年辽宁省甲1亚型流感病毒演变情况和特征，为我省乃至我国流感的监测和预防提供参考。

　　1  材料与方法

　　1.1  毒株及其来源 

　　甲1亚型流感毒株A1/Liaoning/225/2005,A1/Liaoning/256/2005,A1/Liaoning/253/2005,A1/Liaoning/487/2006,A1/LiaoShen/064-3/2001,A1/LiaodDa/0224/2001,A1/Liaoning/35/2002,A1/Liaoning/25/2000,A1/Liaoning/20/2000均来自经鉴定、深冻保存的辽宁省流感监测点医院和省内疑似流感疫情爆发的体温>38℃,上呼吸道感染的类流感病人的咽拭子和含漱液标本分离的流感病毒。另14毒株序列来自GenBank。

　　1.2  毒株培养 

　　实验中所有病毒均用狗肾传代细胞(MDCK)进行培养。培养方法按文献〔4〕进行。

　　1.3  病毒RNA的提取 

　　采用新鲜病毒细胞培养液试剂盒(德国QIAGEN公司)，按说明书提取病毒RNA。

　　1.4  逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 

　　所有引物为H1 HA亚型鉴定引物：5′ACT，ACT，GGA，CTC，TGC，TGG，AAC3′，5′CAA，TGA，AAC，CGG，CAA，TGG，CTC，C3′，由大连宝生物公司合成。其他试剂包括逆转录酶、RNAsin、TapDNA酶、dNTP(美国Progema公司)。RT-PCR方法见文献〔5，6，7〕。

　　1.5  PCR产物的纯化及序列测定

　　RT-PCR产物按照(德国QIAGEN公司的QIAQUICK Gel Extraction Kit)说明书进行纯化。纯化的扩增产物上样ABI 3100 avant全自动测序仪，从正反2个方向进行HA1基因序列测定〔3〕。

　　1.6  序列分析 

　　核苷酸和氨基酸序列均采用DNAMAN(version 4.0)，Clustalx1.83和Mega 3.0软件，用Alignment、Neighbor Joining〔3〕对结果进行同源性比对和分析处理。

　　2  结  果

　　2.1  辽宁省流感监测各型别分离株 

　　辽宁省从2000年始参加WHO流感监测以来，在初3年均分离到甲1亚型流感病毒，3年后于2005年秋又重新出现，我们随机选用了9株不同年份的辽宁地方甲1亚型流感病毒经RT-PCR、测序，并用Sequin软件提交到GenBank，获得序列号。

　　2.2  辽宁省甲1亚型流感病毒序列变异(图1)
 
　　9株甲1亚型流感病毒序列与GenBank中的我国其他省份甲1亚型毒株序列、与WHO的甲1亚型疫苗株、与1918年H1N1流感株及世界各地2005年甲1毒株序列进行比对〔5〕，并用DNAMAN软件包中的Alignment做了差异和同源性比较，用Mega软件包中的Neighbor Joining和Maximum Parsimony 2种方法制作种系进化树。

　　2.3  甲1亚型HA1不同氨基酸位点比较(表1)表1  甲1亚型HA1不同氨基酸位点比较（略）注：·表示相同氨基酸(与疫苗株比较)；W：色氨酸；Y：酪氨酸；谷氨酰胺；V：缬氨酸；R：精氨酸；F：苯丙氨酸；K：赖氨酸；A：丙氨酸。

　　3  讨  论

    本文结果表明，除A/NewYork/1/1918和A/PuertoRico/8/34/MountSinai外，其他毒株可大致分成2个组，以A/HongKong/1134/98株为界。辽宁2005年末与2006年初的H1N1株自成一组，与疫苗株和往年株聚类分析属不同的亚组，已有多处碱基变异，在其HA1蛋白分子上有4个氨基酸位点发生了替换，与甲1亚型疫苗株A/New Caledonia/20/1999同源性有下降趋势。

    流感病毒的抗原变异与流感的发生和流行密切相关，流感病毒正是通过不断改变其抗原性来逃避宿主特异性免疫的识别和清除，从而引起流行。尤其以血凝素抗原HA1区基因的变异为重要。通过对辽宁省2000～2006年部分甲1亚型流感毒株血凝素基因重链区核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析，结果表明，辽宁省2000～2006年重现的甲1亚型毒株与疫苗株A/NewCaledonia/20/1999比较〔6〕，已出现大于3%的核苷酸序列差异，提示其抗原可能发生部分漂移或更换。氨基酸序列上有意义的突变为187位W>R，188位Y>F，209位Q>K，249位V>A，并且这种变异的毒株正逐步在2006年占有优势。WHO的H1N1疫苗株2001开始至今一直是A/NewCaledonia/20/1999Vaccine〔6〕而没有更换。

    这些均预示对2006年流感监测，特别是甲1亚型的核酸序列变异应重点监测、关注，对WHO正确选定疫苗株、流感的预防控制，对流行季节疫苗选择和流行病学研究均具有积极和重要意义。

 

【参考文献】
  　　〔1〕Antonovics J,Hood ME,Baker CH.Molecular virology:was the 1918 flu avian in origin?［J］.Nature,2005,6,437(7060):889-893.

　　〔2〕吴少慧，于伟，张眉眉，等.辽宁省1999～2005年度流感病原学监测［J］.中华流行病学杂志，2006，27(3)：238-240.

　　〔3〕陈继明，郭元吉，郭俊峰，等.1990～2000年间我国乙型流感病毒HA1基因演变的特征［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2002，16(3)：278-280.

　　〔4〕郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术［M］.北京：中国三峡出版社，1997：87-106.

　　〔5〕Saiki RK,Gelfand DH,Stottels A,et al.Primerdirected enzymtic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase［J］.Science,1988,239:487-491.

　　〔6〕李敏江，史雯，茅海燕，等.浙江省流行性感冒病毒分离株HA1基因分析［J］.中国公共卫生，2006，16(7)：838-840.

　　〔7〕张岚，段卫平，陈锦英，等.乙型流感病毒的RT-PCR-SSCP初筛分类［J］.中国公共卫生，2006，20(10)：1229-1232