Gelsolin蛋白与非小细胞肺癌转移的关系

   　作者：竺王玉1,2,周吉航1,黄燕燕1,刘晓光　　作者单位：1.舟山医院 舟山医院-中科院免疫基因组学联合实验室，浙江 舟山 316004;2.温州医学院，浙江 温州

　　【摘要】目的： 探讨凝溶胶蛋白(Gelsolin)在预测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)临床病理特征、癌细胞转移和患者预后中的价值。方法：采用SP免疫组化法检测63例有完整资料的NSCLC患者癌组织标本及63例癌旁组织标本Gelsolin蛋白表达，分析Gelsolin与NSCLC患者临床病理特征和转移、预后的关系。结果：Gelsolin蛋白在63例癌旁组织中均为弱阳性表达，在肺癌细胞中的阳性表达率为31.7%(20/63);Gelsolin蛋白阳性表达与NSCLC组织学类型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析显示Gelsolin蛋白阳性患者生存率较Gelsolin蛋白弱阳性或阴　　性患者为低(P<0.05);Cox风险比例模型显示淋巴结转移及Gelsolin蛋白阳性可显著增加NSCLC患者的死亡风险(P<0.05)。结论：Gelsolin基因在NSCLC发生发展中起重要作用，与NSCLC转移及低生存率有关，可作为临床早期发现NSCLC转移及预测预后的指标。

　　【关键词】癌，非小细胞肺;凝溶胶蛋白;转移;预后

　　Abstract: ob[x]jective: To probe the value of Gelsolin in the prediction of theclinicopatho-logical features，me[x]tastasis of cancerous cell and prognosis of patients withnon-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: SP immunohistochemical was used to detect theex[x]pression of Gelsolin protein in 63 lung carcinoma and 20 paracancerous tissue.Results: Thepositive rate of Gelsolin protein in lung carcinoma was 31.7%(20/63)while the exprssion of lungparacacerous tissues was all weakly positive.In the carcinoma tissues，the positive ex[x]pressionof Gelsolin protein in NSCLC was signifi-cantly related to histotype degree，the degree ofdifferentiation，size of tumor and lymph node me[x]tastasis (P<0.05);Kaplan-Meier survival analysisshowed that the survival time of Gelsolin positive patients was shorter than that of Gelsolinnegative or weakly positive patients (P<0.05);Cox regression analysis revealed that lymphnode me[x]tastasis and Gelsolin positive ex[x]pression were the noticeable affective factors on thedeath of the NSCLC patients after surgery. Conclusion: Gelsolin plays an important role in thedevelopment in NSCLC and was associated with transfer and low survival rate in patients with NSCLC，which can be used as an early indicator of NSCLC me[x]tastasis and predict- ation of prognosis.

　　Key words: cancer，non-small cell lung;Gelsolin;me[x]tastasis;prognosis

　　肺癌作为威胁全世界人类健康的重大疾病，死亡率高。I期非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)患者手术后5年生存率可高达70%，但若只接受手术治疗则80%的患者术后复发，而IV期肺癌手术后5年生存率还不到1%，这主要与肺癌易广泛隐匿转移有关[1]。肺癌的侵袭转移是多基因参与，多阶段，多步骤发生发展的过程，其中肺癌细胞运动在肺癌转移过程中发挥了重要作用。Gelsolin蛋白为一种肌动蛋白结合蛋白，可重组肌动蛋白丝，与细胞运动密切相关。为寻找NSCLC转移预后的标志物，我们应用SP免疫组化方法，分析NSCLC患者Gelsolin表达与临床病理特征及患者生存率间的关系，以探讨Gelsolin基因在NSCLC发生发展中的作用及意义。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　选取2006年6月至2009年6月在浙江省舟山医院行肺癌术后的NSCLC患者63例，取距癌灶>6 cm的癌旁组织作对照组。63例患者中男40例，平均年龄(66.7±8.8)岁;女23例，平均年龄(60.0±8.6)岁;患者术前均未经放疗、化疗或其他方法治疗，也未患有其他癌症，术后生存期>1月。所有患者均详细记录病理资料及术后随访资料。TNM分期根据2009年国际抗癌联盟WHO肺癌分类标准，鳞癌25例，腺癌25例，细支气管肺泡癌13例;淋巴结转移19例，远处转移1例。

　　1.2 试剂

　　鼠抗人Gelsolin单克隆抗体(ABS017，SC57509)购自Santa Crus公司，多克隆抗兔、鼠二抗购自Invitrogen公司(REF 87-8973)，免疫组化试剂(SP9002)和DAB显色液(ZLI9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 检测方法

　　采用SP免疫组化法。石蜡切片(切片厚度为5μm)常规脱蜡，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，一抗孵育前0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)煮沸微波抗原修复，　　加入10%的BSA(牛血清白蛋白)37 ℃孵育，加Gelsolin鼠抗人单克隆抗体(1:100稀释)4 ℃过夜，加HRP(辣根过氧化物酶)标记多克隆羊抗兔、鼠二抗37 ℃孵育，DAB 染色，苏木素　　复染。用PBS代替一抗做空白对照。

　　1.4 判断标准

　　Gelsolin蛋白表达于巨噬细胞、成纤维细胞、正常肺上皮细胞及肺癌细胞。按染色强度计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;巨噬细胞为3分、成纤维细胞2分、正常肺上皮细胞1分。在高倍镜(×400)下取10个不同视野，各计数100个细胞，按阳性细胞所占的百分比计分：阴性为0分，阳性细胞<10%为0分，10%～39%为1分，40%～69%为2分，>70%为3分。染色强度与阳性细胞百分比的积分乘积，0分为阴性(-);1～3分为弱阳性(±或various);≥4分为阳性(+)。

　　1.5 统计学处理方法

　　计数资料用率表示，不同组间比较用Kruskal-Wallis H 检验或Fisher精确概率法，Gelsolin蛋白影响因素采用Logistic回归模型分析;生存率的比较采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，预后因素采用Cox分析。

　　2 结果

　　2.1 Gelsolin蛋白的表达

　　Gelsolin蛋白表达于肺癌细胞的胞浆及胞膜，呈弥漫性或局灶性不均匀分布，阳性表达率为31.7%(20/63)，弱阳性表达率为44.5%(28/63)，阴性为23.8%(15/63)，见图1-3。20例癌旁组织均为弱阳性表达。

　　2.2 NSCLC 组织中Gelsolin蛋白表达与临床病理学特征的关系

　　NSCLC中Gelsolin蛋白表达与肺癌组织学类型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，而与年龄、性别、吸烟状况、是否累及脏层胸膜及远处转移无关(P>0.05)，见表1。以Gelsolin蛋白表达为应变量(阴性及弱阳性=0，阳性=1)，以性别(男=0，女=1)、吸烟情况(否=0，是=1)、组织学类型(鳞癌=0，腺癌=1，细支气管肺泡癌=2)、分化程度(中高分化=0，低分化=1)、肿瘤大小(≤3 cm=0，>3 cm =1)、累及脏层胸膜(否=0，是=1)、淋巴结转移(无=0，有=1)、临床分期(I期=0，II～IV期=1)为自变量，做Logistic回归分析显示，Gelsolin蛋白阳性表达与肺癌组织学类型、肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移有关　(P<0.05)，见表2。

　　2.3 NSCLC组织中Gelsolin蛋白表达与患者术后生存期的关系

　　对63例患者进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示，随访1～4年后，Gelsolin蛋白表达阴性组患者自肺癌术后未见有死亡，Gelsolin蛋白表达弱阳性组患者平均生存期为(36.2±9.5)个月，Gelsolin蛋白表达阳性组患者平均生存期为(30.9±6.5)个月，Log-rank检验P=0.032，　差异有显著性(见图4)。

　　2.5 NSCLC患者术后死亡的Cox分析

　　除患者年龄外，其他变量赋值情况同Logistic回归分析。Cox分析结果显示临床分期II～IV期、淋巴结转移及Gelsolin蛋白阳性表达情况为患者预后的危险因素(P<0.05)，见表3。

　　3 讨论

　　Gelsolin初发现于兔巨噬细胞，是凝溶胶蛋白超家族的成员之一，可调节胞浆肌动蛋白(actin)胶态与液态(gel-sol)之间转换，为重要的肌动蛋白结合蛋白，参与细胞骨架构成，在信号传导、细胞运动、细胞凋亡、甚至肿瘤发生的调节等方面发挥重要的作用[2]。本结果显示Gelsolin蛋白在正常肺上皮细胞中呈弱阳性表达，在肺癌细胞的阳性表达率为31.7%(20/63)，弱阳性表达率为44.5%(28/63)，阴性表达率为23.8%(15/63)。肺癌细胞Gelsolin蛋白表达高于正常肺细胞， 说明其与肺癌发生有一定关系;但同时，有一部分肺癌患者Gelsolin蛋白表达减低，一定程度上提示其尚在肿瘤早期阶段。当Gelsolin表达下调时，肿瘤细胞可逃逸由caspase 3引起的细胞凋亡，然后，当肿瘤细胞侵袭能力增加后，将重新表达Gelsolin以提高细胞运动能力[3]。史伟峰等[4]报道在乳腺癌中Gelsolin分子表达显著减低，敲除Gelsolin基因能够促使人乳腺上皮细胞转变为间叶细胞，导致人乳腺癌的发生[2]，均提示Gelsolin在肿瘤早期具有抑制肿瘤细胞生长的潜能[5]。

　　分析Gelsolin蛋白与临床病理特征的关系发现，在NSCLC发生的早期，如恶性程度较低　的细支气管肺泡癌、高-中分化期、肿瘤≤3 cm、I期、无淋巴结转移患者Gelsolin呈阴性表　达;而恶性程度相对较高的腺癌、鳞癌、低分化期、肿瘤>3 cm、II～IV期、有淋巴结转移　　者Gelsolin呈阳性表达，说明Gelsolin具有增加肿瘤细胞运动和侵袭转移的能力[6-7]。Logistic回归分析亦显示腺癌、鳞癌、低分化期、II～IV期、有淋巴结转移与Gelsolin蛋白阳性表达相关。

　　本研究结果还显示Gelsolin蛋白阳性表达与淋巴结转移一起可增加NSCLC患者的死亡风　　险，有淋巴结转移患者Gelsolin蛋白阳性表达率达57.9%，说明Gelsolin蛋白阳性表达可增强细胞运动功能，从而促进NSCLC细胞的侵袭转移能力。有研究表明在高淋巴道转移力肝癌　　腹水型细胞Hca2F的Gelsolin蛋白表达是低转移力细胞Hca2P的1.7倍，亦提示Gelsolin在肿瘤转移发生发展过程中起促进作用[5]。Kaplan-Meier生存分析显示Gelsolin蛋白表达阳性者生存率明显低于Gelsolin蛋白阴性或弱阳性表达者，与多项研究结果一致[8-11]，亦说明elsolin可能为肺细胞异质性的一个参数，它可增强肺癌细胞的运动，使肺癌细胞的浸润迁移能力增强，易引起肺癌的转移，预后较差。因此，检测Gelsolin蛋白可作为一种蛋白标志物，预测NSCLC侵袭转移情况，对发现NSCLC早期转移[11]，预测预后有重要意义。可见，Gelsolin基因在NSCLC发生发展中起重要作用，与NSCLC转移及低生存率有关，可作为临床早期发现NSCLC转移及预测预后的指标。