心炎宁颗粒剂对柯萨奇病毒B组感染心肌细胞保护作用的实验研究

　　作者：周游,刘芳,王雪峰,闫丽娟,南春红　　作者单位：110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生院(周游);，辽宁中医药大学附属医院儿科(刘芳，王雪峰，闫丽娟，南春红)

　　【摘要】目的在病毒性心肌炎心肌细胞模型上观察心炎宁颗粒剂对柯萨奇病毒B组(CVB3m)感染SD大鼠心肌细胞的保护作用。方法体外原代培养的新生SD大鼠心肌细胞，感染CVB3m作为病毒性心肌炎心肌细胞模型，体外给予心炎宁颗粒剂后分别测定大无毒剂量(TD0)、细胞病变(CPF)、半数致死量(TCID50)，分析其对心肌细胞的保护作用。结果　不同浓度的心炎宁颗粒剂对心肌细胞的保护率差异有统计学意义(P<0.05);4TD0、TD0、1/2TD0、1/4TD0对心肌细胞的保护率明显高于1/8TD0，差异具有统计学意义(P<0.05),4TD0、1/4TD0对心肌细胞的保护率与1/32TD0之间差异也存在统计学意义(P<0.05)。结论　心炎宁颗粒剂对CVB3感染心肌细胞有明显的保护作用。
　　【关键词】 心炎宁颗粒剂/治疗应用;　柯萨奇病毒B组病毒;　心肌细胞;　肠道病毒;　实验，动物
　　【Abstract】　ob[x]jective　To observe the protective effect of Xin Yan Ning Granule on myocardial cells infested with Coxsackie virus B3 (CVB3m) in the vira myocarditis myicardial cell model.Methods　Viral myocarditis myocardial cell model was made by in vitro primary cultured myocardial cells in neonatal SD rat， infected with CVB3m， given Xin Yan Ning Granules respectively to determine of the maximum toxic dose (TD0)， cell lesions (CPF)， median lethal dose (TCID50)， and the protection effect on myocardial cells.Results　The rate of different concentrations of Xin Yan Ning Granule on myocardial cell protection had a significant difference (P< 0.05);the protection rate of 4TD0， TD0， 1/2TD0， 1/4TD0 on myocardial cells was significantly higher than that of the 1/8TD0， the difference being statistically significant (P<0.05);the protection rate of 4TD0 and 1/4TD0 on myocardial cells had a significant statistical difference from that of 1/32TD0(P<0.05).Conclusions　Xin Yan Ning Granule has a significant protective effect on myocardial cells with CVB3 infection.

　　【Keywords】　Xin Yan Ning Granule;　Coxsackie B virus;　myocardial cells

　　病毒性心肌炎(viralmyocarditis，VMC)是嗜心性病毒侵犯心肌引起的急性或慢性炎症，是小儿较常见的疾病。主要临床表现为乏力、心悸、胸闷、气短，活动后加重。部分患者可迁延或遗留各种心律失常，少数爆发型心肌炎可引起几小时或几日内猝死[1]。目前已知，很多病毒均可引起心肌炎，包括EB病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirusb，CVB)、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒，呼吸道病毒如流感病毒、腺病毒，带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒等均可引起心肌炎。其中以肠道病毒为常见，以CVB常见，尤其柯萨奇病毒B组(CVB3m)是致心肌炎的主要病毒[2]。中医药在治疗VMC方面有很明显的优势，效果较好，近几年由于中药制备工艺的改进，许多中药提取物或中药有效成分抗CVB的研究逐渐增多，研制出了一些效果很好的中成药复方制剂[3]。笔者前期临床应用小柴胡汤治疗VMC取得了显著疗效，并研制出心炎宁颗粒剂应用于临床。本研究以实验性体外VMC模型探讨心炎宁颗粒剂的心肌细胞保护作用。
　　1　材料与方法
　　1.1　实验动物

　　SD大鼠20只，(220±10)g雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(证书号：SCXK(京)2007-0001)。SD大鼠2～3 d的乳鼠35只，购自中国医科大学动物中心(证书号：SYXK(辽)2008-0005)。
　　1.2　实验药物

　　心炎宁颗粒剂由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供，批号：辽卫药制字(96)G046-06。
　　1.3　病毒

　　CVB3m(Nancy株)由上海中山医院VMC重点实验室杨英珍教授惠赠。在Halle细胞上连传2代，细胞病变至“+++～++++”(75%以上细胞发生病变)后，反复冻融3次，3 000 r/min离心30 min，取上清液置-80 ℃超低温冰箱保存。测半数组织感染量(TCID50)为10-4。
　　1.4　细胞

　　Hela细胞，来源于辽宁中医药大学儿科病毒室，生长液为DMEM，加入10%已灭活的胎牛血清，抗生素(青霉素，链霉素)，在37℃培养箱中培养备用。
　　1.5　实验仪器

　　CO2培养箱(Nuaire-4950E，美国)，酶标仪(Bio-RAD)，倒置荧光显微镜(德国LECIA)，CMIAS医学图像分析管理系统(北京中山)，超低温冰箱(日本SONY，MDF382E)，微量细胞培养板(美国COSTAR)，生物安全柜(美国Nuaire-4950E)，电热恒温培养箱(上海跃进，H.HB11420)。
　　1.6　实验试剂

　　DMEM，赛默飞世尔生物有限公司(批号NVG0295);胎牛血清，天津市灏洋生物制品有限公司(批号：20100310);PBS缓冲液，赛默飞世尔生物有限公司(批号：NVD0258);青霉素、链霉素(PS)，华北制药股份有限公司(批号0906306(P)1004101(S));谷胺酰氨，天津市氨基酸公司(批号：08.10.20);MTT，美国华美试剂公司提供(批号MV414.32)，用培养液配制成5 mg/mL的溶液。胰蛋白酶溶液(联星生物，规格：250 g)根据实验要求配制。
　　1.7　实验方法

　　1.7.1　心肌细胞的培养和制备

　　取新生2～3 d的SD大鼠乳鼠，在无菌条件下分离心室肌组织，将心室肌剪成约1 mm3大小的碎块，用0.23%胰蛋白酶溶液消化，制成细胞悬液。通过200目孔径不锈钢网过滤，以除掉未充分消化的组织块。96孔细胞培养板，每孔接种200 μL细胞，放于37 ℃5%CO2培养箱培养，每48 h换培养液1次[4]。
　　1.7.2　实验药物对细胞毒性的测定

　　用培养液将实验药物稀释成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024,10个浓度，加入已制备好的单层Hela细胞上，每孔200 μL，每一稀释度设4个复孔。正常细胞组以培养液代替药液，培养2 d，逐日观察细胞生长情况。以正常细胞为对照，不引起细胞病变的高药物稀释度为大无毒浓度(TD0)[5]。
　　1.7.3　CVB3m病毒毒力滴定

　　采用微量细胞培养法[6]测定TCID50。将病毒按10倍递次从10-1稀释至10-8，接种于长满单层细胞的微量培养板上，每孔200 μL，每一稀释度设4个复孔。放于37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育2 d,24 h后开始逐日观察细胞病变，进行记录，48 h细胞病变达“++”(50%细胞出现病变)以上病变为阳性孔，无病变或病变在50%或以下作为阴性孔，按Reed-Muench法测定病毒的TCID50。
　　1.7.4　实验药物对体外病毒感染乳鼠细胞的保护作用

　　心肌细胞培养24 h后，已呈规律搏动的各孔心肌细胞中，吸出上清液，每孔加入TCID50 CVB3m 100 μL吸附1 h，用Hank's液洗去病毒，加入不同浓度的药物或正常维持液培养。药物分八个浓度4 TD0、2 TD0、TD0、1/2 TD0、1/4 TD0、1/8 TD0、1/16 TD0、1/32 TD0，同时设正常细胞对照组，病毒对照组。
　　1.8　观察指标

　　1.8.1　观察细胞病变

　　每组自接种病毒24 h后，逐日在倒置显微镜下观察细胞病变。～25%细胞病变为“+”;～50%细胞病变为“++”;～75%细胞病变为“+++”;～细胞病变为“++++”。
　　1.8.2　MTT法检测细胞活性
　　接种病毒72 h后，吸弃培养上清液，用37℃ pH7.6的PBS洗涤1次，每孔加180 μL培养液，再加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h。小心吸弃孔内培养上清液100 μL，加入等量含0.04 mmol/L盐酸异丙醇溶液，振荡5 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长酶标检测仪测定各孔光吸收值，记录结果。计算药物保护率=(感染给药OD-病毒对照OD)/(正常细胞对照OD-病毒对照组OD)×。
　　1.9　统计学方法
　　采用SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料以x-±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD分析方法。P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2　结果

　　2.1　实验药物对细胞毒性的测定

　　见表1。表1　细胞病变法观察表1结果说明，加入药物48 h后心炎宁对Hela细胞的TD0是1∶8。
　　2.2　病毒毒力测定结果

　　本次实验所用CVB3m病毒的TCID50为10-4。
　　2.3　MTT法测定药物对体外感染心肌细胞的保护率

　　见表2。表2　MTT法测定不同浓度药物对心肌细胞感染CVB3m的保护率表2结果说明，不同浓度的实验药物对心肌细胞的保护率差异有统计学意义(P<0.05),4 TD0、TD0、1/2 TD0、1/4 TD0对心肌细胞的保护率明显高于1/8TD0，差异具有统计学意义(P<0.05)，4 TD0、1/4 TD0对心肌细胞的保护率与1/32 TD0之间差异也存在统计学意义(P<0.05)。
　　3　讨论

　　VMC是指病毒侵犯心脏所引起心肌细胞变性、坏死和间质炎性细胞浸润及纤维渗出的过程。本病的发病机制至今尚未完全阐明，但现已基本明确病毒直接损害心肌细胞和机体的免疫反应是VMC的主要发病机制[6]。众多的研究结果已表明，急性病毒感染可直接损害心肌细胞，病毒可溶解培养的心肌细胞，并在炎症反应发生前已损伤心肌组织，心肌病变主要是由病毒直接作用所致。
　　VMC在祖国医学中被记载为心悸，是小儿常见病症之一，在临床实践中发现肠道CVB感染所致VMC的“发热，心烦，胸闷，气短，乏力，食欲不振，手足不温”等症状与《伤寒论》[7]96条“伤寒五六日，往来寒热，胸胁苦满，嘿嘿不欲饮食，心烦喜呕，或腹中痛，或心下悸，……或咳者，小柴胡汤主之”和148条“伤寒五六日，头汗出，手足冷，心下满，口不欲食，脉细者，此为阳微结，必有表，复有里也，可与小柴胡汤”所述的症状十分相似，究其病机及治则基本符合伤寒论中的小柴胡汤证。
　　心炎宁颗粒剂由柴胡、黄芩、丹参、麦冬等中药组成，由小柴胡汤化裁而来。前期实验已证明，小柴胡汤具有抗CVB病毒感染、保护心肌细胞、调节免疫、改善心功能的作用。其君药柴胡、黄芩提取物均可促进损伤的心肌细胞减轻病变，起到不同程度的保护作用[8,9]。临床研究表明丹参和麦冬均有保护心肌的作用[10]。本实验观察到心炎宁颗粒剂对CVB3感染心肌细胞具有保护作用，且不同浓度对CVB3感染心肌细胞的保护率之间有明显的差异，说明心炎宁颗粒剂达一定的剂量可抑制细胞病变，对CVB3感染的乳鼠心肌细胞有明显的保护作用。
　　【参考文献】
　　[1]　李春红，王飞.心肌炎的临床诊治[J].社区医学杂志，2010,8(20)：911.

　　[2]　陈曙霞，谢龙山，马睿，等.柯萨奇B病毒性心肌炎、扩张型心肌病中病毒持续感染及中药干预的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2003,1(3)：129131.

　　[3]　张广文，白雪，杨思进.中药抗病毒性心肌炎的实验研究现状[J].内蒙古中医药，2007,26(12)：3435.

　　[4]　李润琴，穆晓玲.新生大鼠心肌细胞培养技术[J].山西医药杂志，2007,36(2)：103105.

　　[5]　王卫华，肖红，陈科力，等.虎杖提取液抗柯萨奇病毒B3的实验研究[J].湖北中医杂志，2001,23(9)：4748.

　　[6]　杨英珍.病毒性心肌炎[M].上海：上海科学技术出版社，2001：160,27.

　　[7]　熊曼琪.伤寒论[M].2版.北京：人民卫生出版社，2011：197.

　　[8]　王雪峰，刘芳，魏克伦，等.小柴胡汤及其分解剂对柯萨奇B3m病毒感染乳鼠心肌保护及免疫调节作用的研究[J].中西医结合杂志，2000,20(8)：599602.

　　[9]　蒋丽敏，王雪峰，魏克伦，等.小柴胡汤对体外病毒性心肌炎模型的心肌细胞酶组织化学的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，2002,22(3)：298.

　　[10]　刘晓东，赵媛菊，赵建强，等.大剂量参麦注射液治疗儿童病毒性心肌炎疗效观察[J].中国实用儿科杂志，2003,18(10)：632.