2022 EHA | 华中科技大学同济医学院附属协和医院CAR-T细胞疗法相关基础研究结果公布，助力CAR-T细胞治疗进展

免疫疗法在血液肿瘤领域蓬勃发展，为包括淋巴瘤、白血病在内的多种类型的血液肿瘤患者带来了更多的治疗选择以及更好的生存获益。华中科技大学同济医学院附属协和医院胡豫教授和梅恒教授团队的两项关于CAR-T细胞疗法的基础研究入选了2022年EHA大会的壁报展示，医脉通将主要内容整理如下。

BTK抑制剂通过调节免疫系统改善靶向CD19 CAR-T疗法的疗效

靶向CD19 CAR-T细胞疗法在B细胞淋巴瘤和白血病患者中取得了卓越的疗效。然而，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）在内，复发和不良反应仍然是CAR-T疗法疗效的障碍。CRS和ICANS发生所需的细胞因子主要来源于单核细胞和巨噬细胞。鉴于布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）在骨髓细胞中的表达水平较高，梅恒教授和胡豫教授团队认为BTK抑制剂可以通过调节免疫系统来改善CAR-T疗法的疗效，因此进行了这项研究。

正常T细胞和靶向CD19 CAR-T细胞分别在三种BTK抑制剂药物中培养4天，包括伊布替尼（IB）、泽布替尼（ZB）、奥布替尼（OB），通过流式细胞术（FCM）分析免疫和分化表型，包括PD1、TIM3、CTLA4、CD25、CD69和CD28、CD45RA和CD62L。在24小时共培养中，评估CAR-T细胞对NALM-6细胞系的毒性是否会受到BTK抑制剂的影响。CAR-T细胞、NALM-6细胞系和在PMA刺激下由THP-1细胞系分化的巨噬细胞共培养，并通过细胞计数珠测定法检测了上清液中的IL-6。

通过在BALB/c小鼠的皮下注射5x10⁶A20细胞，建立了淋巴瘤小鼠模型。IB、ZB和OB分别以25、10和10mg/kg的剂量处理BALB/c小鼠，口服，每日一次，持续28天。使用0.5%羧甲基纤维素进行载体处理。健康对照组的小鼠不接受额外治疗。采集脾细胞、骨髓（BM）样本和肿瘤标本，制备单细胞悬液，使用FCM分析免疫表型。

与对照组正常T细胞相比，IB处理的T细胞降低了PD-1（62.28% vs 14.95%，P=0.0024）、TIM-3（71.38% vs 7.88%，P<0.0001）和CTLA-4的表达（被CD3/CD28刺激；92.65% vs 15.5%，P<0.0001）；ZB处理的T细胞也出现了抑制标志的下调，但OB处理的T细胞中未出现相应的下调改变。同时，IB和ZB降低了激活标志物的表达并增加了效应记忆细胞亚群，同时减少了幼稚T细胞。BTK抑制剂降低了CAR-T细胞、NALM-6细胞系和巨噬细胞上清液中的IL-6水平，并降低了CAR-T细胞上的CTLA-4表达。BTK抑制剂对CAR-T细胞分化表型未产生影响。考虑到CD3/CD28强烈刺激和信号可以驱动CAR-T细胞终末分化甚至凋亡，研究者认为BTK抑制剂可以保护CAR-T细胞在长期培养和刺激中免受过度激活。三种BTK抑制剂在CAR-T细胞对NALM-6细胞系的毒性中未表现出协同作用。在淋巴瘤小鼠模型中，三种BTK抑制剂增加了肿瘤中1型巨噬细胞（M1）与2型巨噬细胞（M2）的比例以及Th1辅助细胞与Th2辅助细胞的比例，并减少了肿瘤浸润性巨噬细胞。BTK抑制剂能够诱导骨髓组织中T细胞衰竭标志物表达的降低，但该现象未出现在肿瘤标本中。

该研究表明，BTK抑制可以防止CD3/CD28强烈刺激和信号传导导致的CAR-T细胞高度激活进而引起的细胞分化和耗竭。此外，BTK抑制剂可以改变肿瘤微环境，下调IL-6水平，提高靶向CD19 CAR-T细胞疗法的疗效和安全性。

在B-ALL患者中，与疗效和毒性相关的骨髓单核细胞和CAR-T细胞的单细胞转录组学特征

CAR-T细胞疗法在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中取得了出色的临床疗效，已改变B-ALL的治疗格局。然而，只有不到一半的患者能够实现长期缓解，这与治疗相关不良事件同时成为B-ALL治疗的临床挑战。

该研究纳入17例B-ALL患者。4例患者收集了基线状态、输注时、输注后的120780个残留细胞，进行了单细胞RNA测序，以鉴别进行早期预测的生物标志物。另外13例患者采用了bulk-RNA测序进行验证。

在对所有基线状态、输注时、输注后的细胞进行广度无偏差的聚类后，确定了21个的细胞簇。细胞簇被分为五种范围较广的细胞类型：多潜能干细胞（IPS）、造血干细胞和祖细胞（HSPC）、NK/T细胞、骨髓细胞和B-ALL细胞。为预测严重CRS，4例患者根据肿瘤负荷分为两组。主要在高肿瘤负荷患者的B-ALL原始细胞、HSPC中，基线时的细胞因子介导信号增强（患者10和患者8）；而低肿瘤负荷患者，主要为NK/T和骨髓细胞中基线时细胞因子介导信号增强（患者11与患者9）。IFITM1是IFN相关信号通路中的一个基因，在上述细胞类型中上调，并在另外13例患者的bulk-RNA测序数据中得到验证。与完全缓解患者不同，未缓解（NR）患者（患者8）输注前，所有细胞类型的SRGN表达减少，输注时的细胞可能停滞在G1期。在NR患者亚群中，耐药肿瘤簇（C1）富集到了IFN-I信号通路，而药物敏感肿瘤细胞（C3/5/10）发生凋亡。其他通路也被富集到耐药肿瘤簇（C1），包括预测髓外复发的细胞外结构组织相关通路。13例患者的RNA测序数据也是相同结果。

该研究表明，基线状态、输注时、输注后的细胞转录特征的异质性，尽管可能会导致靶向CD19 CAR-T细胞治疗结局的不同，但也有一定的临床预测功能。