细胞性心肌成形术对受损心肌的治疗潜能

　作者：李金轶,钟国强　　作者单位：广西医科大学附属医院心内科，广西心血管病研究所，广西 南宁 530021

　　【摘要】概述干细胞移植治疗受损心肌的研究进展，着重阐述骨髓来源的三种干细胞系移植的现状以及干细胞移植的优缺点、移植方式及待解决的问题。

　　【关键词】 干细胞,细胞移植,心肌梗塞

　　长期以来研究者认为成年心肌细胞是有丝分裂终末期细胞，当心肌受到缺血、炎症等损伤或先天畸形时，虽然采取先进的手术方式、系统的药物治疗和器官移植，受损心肌细胞亦不能再生。但是近几年的研究表明成熟心脏存在极少量的干细胞或前体细胞，这些细胞在心脏中形成储备，并在一定条件下分化成心肌细胞。尽管如此，储备的干细胞或前体细胞来源未明，而且极少量的新生细胞不能有效的地修复受损心肌[1]。

　　细胞性心肌成形术(cellular cardiomyoplasty),即将未成熟细胞移植并修复受损心肌，已成为近几年研究的新兴领域[2]。

　　1 移植细胞的类型及相关研究

　　干细胞(stem cell,SC)是具有自我复制和多向分化潜能的细胞,既能产生表现型和基因型与自己完全相同的子代干细胞,也能在一定条件下分化为各种功能细胞。目前的研究中涉及了多种干细胞的移植。

　　1.1 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)

　　ESC来源于4～5 d胚胎内细胞团(胚泡)或原始生殖细胞，经过体外分化抑制培养和传代后筛选出的具有全能性的细胞。当在适合的培养基和培养条件下，ESC可以无限增殖和保留分化成所有类型细胞的能力，包括心肌细胞[2]。

　　在体外，Kehat等[3]将人ESC成功诱导分化成可自发收缩的心肌样细胞，收缩时间长可持续5周。这些细胞有肌纤维样超微结构，能表达肌球蛋白重链(MHC)α肌动蛋白、支架蛋白、心肌肌钙蛋白及心房利钠肽(ANP)等人类心肌特异性标志物。Min等[4]将培养的ESC经绿荧光蛋白(GFP)标记转染后注入小鼠心肌梗死模型，6周后发现移植组心功能明显好于对照组，移植细胞在移植组梗塞区心肌中存活和分化并表达α-肌动蛋白、肌球蛋白重链和肌钙蛋白。另一项研究更是发现ESC来源的心肌样细胞与心肌细胞之间可形成功能性的缝隙连接(GJ)，对钙离子产生敏感性收缩;单个新生成的心肌样细胞也具有兴奋-收缩偶联的性质[5]。目前ESC移植还不提倡用于临床，原因有：(1)需要免疫抑制剂抑制移植后产生的排斥反应;(2)移植后有形成畸胎瘤的可能;(3)涉及道德、伦理等诸多存在争议的问题[2]。

　　1.2 骨髓来源的干细胞

　　骨髓含有三种干细胞系：造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)和骨髓间充质干细胞(MSCs)。HSC具有全血细胞系的再生能力;EPC与血管的发生和重建有关;MSCs则是20世纪70年代以来发现的骨髓中一小部分具有多向分化潜能的细胞。尽管目前采用了贴壁分离法、密度梯度离心法及流式细胞仪等多种方法，但如何在骨髓中将三种干细胞高纯度分离的问题至今还未完全解决。

　　1.2.1 HSC：HSC为骨髓中含量多的干细胞系，但数量稀少,大约104到105个骨髓细胞中含有1个HSC。尽管如此，1到50个HSC便可重建整个淋巴造血系统[6]。它还能自我更新，分化成多种类的特化细胞，特定条件下动员至外周血[2]。在肿瘤、造血系统和免疫系统障碍中，HSC移植已成为一种成熟的治疗手段。

　　Orlic等[7]研究中将富含HSC(Lin-c-kit+)的成体骨髓细胞群直接注射到心肌梗死的8周龄雌性鼠(C57BL/6)的梗塞区中，发现广泛的心肌再生。同时他们还通过生长因子(GF)动员骨髓细胞入外周血的方法在8周龄雄性鼠(C57BL/6)心梗模型中观察到类似的结果。Wagers等[8～10]的实验未发现HSC能分化成心肌细胞。研究者认为可能是移植细胞亚群的差别、标记基因的敏感性及稳定性的差异或者是细胞融合造成了实验结果的偏差[11]。Wollert开展的一项随机化骨髓移植临床实验[12]结果显示左室射血分数(LVEF)均值在移植组和对照组中分别提高了7%和0.7%。另一项相似的临床研究中[13]，移植组接受了数量为8×109～10×109个自体骨髓细胞经冠状动脉(冠脉)移植，而对照组则以等体积生理盐水注射。3个月和6个月后，移植组在心输出量、室壁运动能力、LVEF等指标上比对照组有显著提高。

　　1.2.2 EPC：循环中的EPC来源于骨髓并能分化成内皮细胞。它在缺血组织和损伤血管中分别有着显著的新生血管形成和内皮化作用。近来小规模的实验已经初步证明了EPC治疗心肌梗死和四肢严重缺血的可行性、安全性和有效性[14]。但研究还发现，年龄增长和心血管疾病危险因素可以不同程度的降低或破坏循环中EPC的治疗作用。循环血中的EPC数相对缺乏也限制了其扩增能力和治疗潜能。

　　直接注射纯化的EPC[15]和通过细胞因子化学增活剂如血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、基质细胞衍生因子(SDF) 等动员EPC[14]到缺血区，EPC可以形成新生血管和改善缺血区供血。Kawamoto 等[16]在外周血中收集EPC并移植到猪心肌缺血模型中，发现移植细胞可以提高左心室血流灌注和运动功能。Massa等[17]证明在急性心肌梗死(AMI)的病人EPC可以被动员至外周血和心脏中并形成新生血管。该实验提示了梗塞心脏区释放入外周血的炎症细胞因子可以触发循环中的骨髓干细胞分化成为特定功能的细胞系。此外，若干小规模的临床实验也取得了令人鼓舞的结果。AMI患者祖细胞移植增强再生研究(TOPCARE-AMI)实验中，20例AMI后4 d再灌注的病人接受了骨髓或外周血来源的EPC的移植，结果显示4月后的LVEF和缺血区室壁运动显著提高，同时心室收缩末径减小[18]。

　　1.2.3 MSCs：MSCs存在于出生后和成年的骨髓腔。它们通过表达多种细胞因子、生长因子及粘附分子等支持骨髓造血。有证据表明，MSCs的数量随着年龄的增长而逐渐减少，如在骨髓细胞的比值中从新生儿的1/104减少到80岁的1/2×106 [19]。另外，在体外经5-氮杂胞苷(5-aza)可诱导动物和成人的MSCs成心肌样细胞。人MSCs还具有无物种限制的免疫调制功能和免疫抑制性质。MSCs的多向分化潜能、与宿主免疫系统的弱应答及体外易扩增性使得其成为干细胞移植较理想的细胞来源。

　　Loren等[2]建立大鼠AMI模型，2 d后将在体外扩增并标记二咪基苯基吲哚(DAPI)和碳花青荧光染料(DiI)标记物的同种异体的大鼠MSCs经静脉移植入梗塞区，2周后通过荧光显微镜检测，发现细胞可移入梗塞区并分化为心肌细胞。Toma 等[20]则将β-半乳糖苷酶报道基因(lacZ)标记的人MSCs注射到成年大鼠的梗塞心肌区域中，14 d后发现移植的细胞内含有结蛋白和肌钙蛋白T，60 d后含有α-肌动蛋白和受磷蛋白。Shake等[21]通过将DⅡ 标记的自体MSCs注射入心肌梗死猪的梗塞区，2周后发现移植细胞表达了心肌特异性蛋白，4周后与对照组相比移植组心脏收缩功能提高，室壁厚度增加。Zhou等[22]对10例AMI患者进行冠脉移植来源于自体髂骨MSCs和单个核细胞的临床研究，其中，7例在PCI术后进行细胞移植，3例未行PCI术，仅行细胞移植。6～12个月后10例患者LVEF提高，移植区心肌灌注得到改善。特别是3例仅行细胞移植的患者其心功能明显改善，LVEF增加了4.0%～18%，心肌灌注得到改善。MSCs易于采集，扩增和冷冻保存，可作为心梗病人细胞移植的备用。但目前还没有的特异抗原表型可满足于实验中对MSCs的鉴定要求。MSCs移植治疗AMI已经通过美国FDA批准，应用于临床。

　　1.3 外周血来源的干细胞

　　研究发现成人外周血中可以分离出多潜能干细胞。它们可以分化为非造血组织如胃肠道和皮肤上皮细胞等[2]。一项研究显示，将成人外周血来源的CD34+细胞通过尾静脉注射到心梗模型大鼠体内，移植细胞可以迁移至梗塞区并分化成心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。有趣的是，研究显示维生素C可以很大程度上提高外周血干细胞迁移至受损组织的能力[2]。Ogawa等将外周血干细胞用于治疗一名扩张型心肌病病人后使扩大的心脏缩小，LVEF增加。

　　1.4 骨骼肌成肌细胞

　　骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblast),具有自体来源方便、高增殖性及较强的局部抗缺血等特点，是较早用于修复受损心肌的细胞来源。但移植研究中表明骨骼肌成肌细胞未能表达心脏GJ和缺乏有组织的收缩功能[23]。Philippe 等对一位72岁的AMI病人行冠脉搭桥术时将来源于病人股外侧肌的成肌细胞注入梗塞区。5个月后症状明显改善，超声心动图显示LVEF提高，前后壁的节段性收缩也明显提高，24 h动态心电图无心律失常发生[24]。

　　2 移植的方式

　　目前有多种方式移植干细胞，即经心肌局部[20]、静脉[8]、导管心内膜和心外膜注射[25]及冠脉注射[14]等。(1)直接心肌局部注射可使干细胞直接到达梗塞区，易结合胸外手术进行。但缺点是需开胸手术且比较费时;(2)经静脉注射不需开胸手术，花费少，是简便的移植方式，但主要的缺点是不能控制干细胞移行至梗塞区域的时间和干细胞在不同时帧里生存能力的不确定性;(3)经导管心内膜和心外膜注射是在直视下注射干细胞并使其均匀分布在梗塞区域。缺点是在注射前需要心肌电机械标测系统，且实验中会诱发诸如室早、室速等心律失常;(4)经冠脉注射采用球囊导管介入亦可以将干细胞直接且均匀移植入梗死区，缺点和其它的方式一样都不能明确移植干细胞所需要的适合的细胞数量[2]。

　　3 基因技术联合干细胞移植

　　基因治疗是指将外源治疗基因通过载体如逆转录病毒、腺病毒等导入心肌细胞并获得表达,从而达到修复坏死心肌的目的。治疗基因主要有VEGF 基因和成纤维细胞生长因子(FGF) 基因。导入的途径包括直接心肌、经冠脉及心包内注射等。但导入基因的过度表达和使用的病毒载体都可能致肿瘤、感染、免疫反应和病毒扩散等。与基因技术联合的干细胞可以为ESC或成体干细胞，但现阶段研究显示ESC的应用潜能大于成体干细胞[26]。

　　4 存在的问题及临床应用前景

　　干细胞移植已经成为当今医学研究领域的一大热点。但发展之初带来新希望的同时，也产生了新的问题。

　　4.1 可塑性

　　细胞融合还是细胞分化?

　　近期的研究提示，细胞融合在成体干细胞移植实验中是常见现象，而此现象对移植细胞修复受损组织提出了新的问题： 融合的细胞是随时间而消失的终末产物还是正常的组织修复过程的中间产物?此外，用于实验的移植细胞存在细小的差异，例如用来自于近亲繁殖系鼠的细胞作为移植细胞，或甚至是移植细胞的细胞周期都可以影响实验结果[12]。

　　4.2 临床研究的不足

　　目前临床上用于评价干细胞治疗受损心肌疗效的方式有：踏车实验，硝酸甘油用量，单光子发射计算体层摄影术(SPECT),电机械标测系统，超声心动图，正电子发射断层扫描术,核磁共振影像学等。研究中采用多种方式评价干细胞治疗受损心肌的疗效更具有说服力。ESC和成体干细胞均可分化为心肌细胞,但移植后分化组织的长期命运及功能尚有待评价。而且从实验设计来说,目前的临床试验多是非随机双盲的,随访的时间也相对较短,其结论的科学性有待进一步研究的证实。在当代以循证医学为基础的医学体系中,需要更多更大规模的随机化研究结果的论证。

　　4.3 研究展望

　　干细胞的研究不仅改变了人们对AMI后心肌细胞难以再生的旧观念,也对临床治疗AMI的传统方法提出了挑战。未来的研究更应该侧重于干细胞的纯化、移植方式的对比、干细胞的可塑性研究以及干细胞植入受损区后生长、偶联和凋亡等机制的研究。

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