唑来膦酸对LM8骨肉瘤细胞VEGF表达和分泌的影响

作者：刘家　　作者单位： 湖北十堰， 郧阳医学院附属十堰市太和医院骨科

　　【摘要】 目的 研究唑来膦酸对骨肉瘤LM8细胞株VEGF表达和分泌的影响。方法 不同浓度的唑来膦酸处理LM8细胞，用RTPCR法检测LM8细胞VEGF mRNA转录水平;免疫组化和ELISA法分别检测VEGF蛋白表达和分泌的水平。结果 LM8细胞中均有VEGF mRNA转录，VEGF蛋白的表达和分泌;与对照组相比，唑来膦酸组(25μmol/L, 50μmol/L)作用LM8细胞24h下调了VEGF mRNA转录，VEGF蛋白的表达和分泌，且对照组和各浓度组之间的差异有统计学意义(P <0.05)。结论 唑来膦酸可抑制骨肉瘤LM8细胞VEGF表达和分泌。

　　【关键词】 唑来膦酸 骨肉瘤 血管内皮生长因子

　　血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通过促进内皮细胞的增殖、生存和迁移而刺激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生长以及生殖活动中是一种生理性血管生成的关键调节因子[1]。新生血管过度增生是一些肿瘤的特征，在多种肿瘤组织中已经发现VEGF表达上调，而且它与肿瘤的进展和不良预后密切相关[2,3]，因此通过干预VEGF从而阻断新血管的生成可能成为一种新的肿瘤治疗手段。

　　双膦酸盐是一种强有力的骨吸收抑制剂， 被广泛地应用于治疗骨质疏松症， 变形性骨炎和恶性肿瘤引起的高钙血症和骨痛症等[4]。 除了强大的抗骨吸收功能外, 双膦酸盐抗肿瘤作用受到越来越多的重视。 本研究采用新一代的双膦酸盐—唑来膦酸作用于骨肉瘤LM8细胞株，观察其对骨肉瘤LM8细胞VEGF表达和分泌等生物学效应的影响， 为唑来膦酸抗骨肉瘤的临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　唑来膦酸(择泰，瑞士诺华制药产品，北京诺华公司惠赠);骨肉瘤细胞株LM8购于第四军医大学实验动物中心;RPMI1640培养液为Hyclone公司产品;RTPCR相关试剂购于北京中山生物公司; VEGF抗体和免疫组化SABC试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品;ELISA试剂盒为晶美公司产品。

　　1.2 细胞培养

　　骨肉瘤细胞株LM8贴壁生长于含10%新生牛血清(NCS)RPMI1640培养液中，于37℃ 、5% CO2的饱和湿度孵箱中培养。生长至70%～80%融合时将细胞用0.25%的胰酶消化后传代，取对数生长期细胞作后续实验。

　　1.3 半定量RTPCR检测mRNA表达

　　LM8细胞置于含不同浓度唑来膦酸的培养液中作用24h,收获培养细胞, Trizol法提取细胞总RNA。逆转录反应体系(20μl)组成：DEPC处理水7μl，5×Bufer 4μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，Oligo(dT)1μl，RNasin 1μl，总RNA 1μl，逆转录酶1μl。42℃ 1h，95℃ 10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：VEGF上游5′ATGAACTTTCTG CTGTCTTGG3′, 下游5′TCACCGCCTCGGCTTGTCACA3′(VEGF165 576bp VEGF121 444bp);βactin上游5′TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3′, 下游5′CTCGTCATACT CCTGCTTGCTGAT3′(172bp)。PCR反应体系(50μl):cDNA模板2μl + 上下引物各3μl+Taq聚合酶0.5μl + dNTPs 1μl + MgCl2 3μl + 10×Bufer 5μl+ddH2O 32.5μl, 94℃ 1min, 55℃ 1min,72℃ 1min,共30个循环,72℃再延伸10min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并行灰度值分析(GelPro Analyzer 4.0分析软件)。

　　1.4 VEGF免疫组化染色

　　置盖玻片于6孔板内。取对数生长期的LM8细胞(细胞浓度1×105/ml)2ml铺于盖玻片上，待细胞贴壁后吸出培养液，每孔加入含唑来膦酸(25μmol/L, 50μmol/L)的培养液2ml，以未加药者为对照组，与细胞共培养24h后，吸去6孔板中的培养液，PBS漂洗后，用无水甲醇和丙酮混合液(1∶1)固定20min。按照免疫组化SABC法试剂盒操作进行。

　　1.5 ELISA法检测VEGF的分泌

　　对照组和试验组经不同浓度唑来膦酸作用24h后，收集培养上清液，按ELISA试剂盒说明书进行操作，反应终止后即刻用酶标仪测定450nm波长处的吸光度A值，标准品和样品孔的A值减去空白孔的A值。以标准品的A值为纵坐标，标准品的浓度(ng/L)为横坐标，绘制标准曲线并拟合标准曲线方程，通过样品的A值在标准曲线方程内求出各样品VEGF浓度。

　　1.6 统计学方法

　　采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析进行多组样本均数间的比较。

　　2 结果

　　2.1 唑来膦酸对LM8细胞VEGF mRNA表达的影响

　　经唑来膦酸作用24h，VEGF mRNA目的条带的灰度随唑来膦酸浓度的增高而逐渐减弱。用目的基因条带与内参条带的比值进行分析，结果显示VEGF mRNA的表达在唑来膦酸浓度为0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L处理组分别为(0.88±0.07)，(0.63±0.09)和(0.18±0.10)，三组总体上的差异具有统计学意义(F=50.997, P<0.05)，并且三组之间的两两比较差异有统计学意义(对照组与25μmol/L唑来膦酸组比较，P = 0.012;对照组与50μmol/L唑来膦酸组比较，P=0.000;25μmol/L唑来膦酸组与50μmol/L唑来膦酸组比较，P=0.001)。说明经唑来膦酸处理24h，VEGF mRNA的表达呈剂量依赖性减弱，唑来膦酸在转录水平影响VEGF的表达。

　　M：DNA mark 1: 50μmol/L唑来膦酸组;

　　2：25μmol/L唑来膦酸组; 3：对照组

　　 唑来膦酸作用24h后VEGF mRNA表达水平

　　2.2 唑来膦酸对LM8细胞VEGF蛋白表达的影响

　　免疫组化SABC法结果显示正常培养条件下骨肉瘤LM8细胞中等强度表达VEGF蛋白，主要分布在胞浆，也有少量胞核着色。25μmol/L唑来膦酸作用24h后，VEGF蛋白表达明显减弱，50μmol/L的唑来膦酸几乎完全抑制LM8细胞的VEGF的表达。

　　2.3 唑来膦酸对LM8细胞VEGF蛋白分泌的影响

　　ELISA测定结果显示，0μmol/L，25μmol/L,50μmol/L唑来膦酸处理组的细胞培养上清液中VEGF蛋白浓度分别为(237.7±17.5)pg/ml,(126.4±6.5)pg/ml,(77.9±5.5)pg/ml, 三组总体上的差异具有统计学意义(F=160.210, P<0.05)，

　　a：对照组;b：25μmol/l唑来膦酸组;c：50μmol/l唑来膦酸组

　　唑来膦酸作用24h对LM8细胞VEGF表达的影响(×400)

　　并且三组之间的两两比较差异均具有统计学意义(对照组与25μmol/L唑来膦酸组：P=0.000;对照组与50μmol/L唑来膦酸组：P=0.000;25μmol/L唑来膦酸组与50μmol/L唑来膦酸组：P=0.002)。因此唑来膦酸抑制LM8细胞分泌VEGF蛋白呈浓度依赖性。

　　3 讨论

　　肿瘤血管形成的调控机制是当今肿瘤研究的热点之一。肿瘤血管形成对实体瘤的生长和转移有重要作用，新生血管为肿瘤组织提供充足的养分，同时发育不完善的微血管也为肿瘤细胞进入循环转移扩散提供便利。抗肿瘤血管生成已经成为众多治疗恶性肿瘤策略中重要靶点。

　　肿瘤血管生成(tumor angiogenesis，TA)是指肿瘤细胞诱导的毛细血管生长及肿瘤血液循环建立的过程，是实体肿瘤生长、侵袭、扩散转移的关键，受多种促血管生成因子及抑制因子的作用，并有多种酶、细胞黏附分子的参与。其中VEGF可特异性作用于血管内皮细胞, 是肿瘤扩增和维持血管功能的关键因子。VEGF作为诱导血管生成的重要因子，主要通过与两种酪氨酸激酶受体VEGFR1和 VEGFR2高度特异性结合，使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路，实现生物学效应[5]。(如诱导内皮细胞增殖、迁移，调节内皮细胞整合素、组织型纤维蛋白溶酶原激活因子、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子、纤溶酶原激活抑制因子以及间质胶原酶在内的多种蛋白酶激活因子的表达，促进胞外基质降解，增加微血管通透性，加速血浆蛋白外渗，终导致新的基质及新生血管腔形成[5]。)研究表明，VEGF不但可以通过特异地作用于内皮细胞上的受体而发挥作用，即通过旁分泌途径诱导血管生成，促进肿瘤生长，而且还可以通过自分泌途径促进肿瘤的生长[6]，进而增加VEGF的分泌，加强其诱导肿瘤血管新生的旁分泌作用。进一步研究显示，VEGF受体并非特异表达于血管内皮细胞，肿瘤细胞亦可表达[7]，这是VEGF自分泌作用机制存在的基础。VEGF在临床实践中具有重要价值，骨肉瘤组织中VEGF的表达水平及血清中VEGF的含量与肿瘤微血管密度、恶性程度和转移情况呈高度正相关，而与患者的预后则呈显著负相关[8]。本项研究检测了骨肉瘤LM8细胞VEGF mRNA转录、蛋白表达和分泌的水平以及唑来膦酸对骨肉瘤LM8细胞VEGF表达和分泌的影响。研究结果显示唑来膦酸可反向调节骨肉瘤LM8细胞VEGF mRNA转录水平以及VEGF蛋白表达和分泌。RTPCR结果显示，随唑来膦酸的浓度增加，VEGF mRNA转录水平明显降低。免疫组化和ELISA实验结果进一步显示，唑来膦酸剂量依赖性抑制VEGF蛋白的表达和分泌。提示唑来膦酸可以通过抑制骨肉瘤细胞VEGF表达和分泌，以旁分泌的方式影响血管内皮细胞的增殖、生长及血管通透性从而抑制肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤的生长和转移，还可能通过自分泌的途径影响VEGF与肿瘤细胞自身表面的受体结合，发挥抑制肿瘤生长等生物学效应。

　　虽然目前已有一些血管生成抑制药物，但大部分由于其不能用于临床，寻找新的高效无毒的血管生成抑制剂已引起人们的重视。唑来膦酸等双膦酸盐药物是一类广泛应用于临床的骨吸收抑制剂，对骨组织尤其是骨转换活跃区域具有很高亲和力，从一定程度上作为天然的骨靶向剂，理论上可以在骨肉瘤组织中积聚很高的浓度以及其相对较小的[9,10]，在骨肉瘤等骨肿瘤中有着广阔的临床应用前景。

　　【参考文献】

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