膀胱癌与细胞死亡途径的FAS和FAS配体基因多态性的关系

　　凋亡是一种程序性细胞死亡,在维持内环境中起重要作用,凋亡失调与包括肿瘤在内的许多疾病的发生相关〔1〕.已有文献报道肿瘤的发生不仅与细胞异常生长有关,而且与癌前细胞延迟凋亡有关,因此异常凋亡可导致细胞无序生长’'.FAS基因,又名肿瘤坏死因子受体基因超家族成员6(TNFRSF6)/CD95/APO-1,编码I种细胞表面因子,FAS配体(FASL)基因,又名TNFSF6/CD95L,编码1种肿瘤坏死因子,这2个基因与凋亡的关系已被越来越多的研究.近年来,多项研究证实FAS和FASL的基因多态性与食管癌、肺癌、宫颈癌等多种癌症存在密切关系人FAS基因定位于第10号染色体长臂2区(10q24.1),包含8个内含子和9个外显子.据报道位于其沉默子区域的位点一1377(FAS-13776>A,rs2234767)和位于增强子区域的位点一670(FAS-670A>G,rs1800682)可能影响FAS基因的表达,与肿瘤的发生相关〔6-S].人FASL基因定位于第1号染色体长臂2区3带(1q23),包含3个内含子和4个外显子.位于其启动子区域的位点一844(FASLG-844T>C;rs763110),可以影响FASL基因的表达{9].本研究旨在检测这3个位点的多态性在湖北汉族人群中的分布,探讨此多态性与膀胧癌发生的相关性.
　　材料和方法 　　
　　1一般资料:2010年9月至2011年1z月华中科技大学同济医学院附属同济医院收治的湖北膀胧癌患者血样标本174例.纳人标准:(1>病理确诊为膀恍移行上皮细胞癌;(2)籍贯是湖北,且长期在湖北生活;(3)未曾做过放化疗.210例湖北正常人群对照样本,由华中科技大学同济医学院附属同济医院体检中心提供.纳人标准:(1、籍贯是湖北,且长期在湖北生活;(2)无恶性肿瘤及其他重大疾病病史.
　　2.基因型检测:采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测FAS-13776>A,-670A>G和FASL-844T>C的多态性扩增目的片段的引物为:FAS-1377G>A;5'-TGTGTGCACAAG-GCTGGCGC-3’(上游),5’-TGCATCTGTCACTGCACT-TACCACCA-3'(下游);FAS-670A>G:}'-ATAGCT-GGGGCTATGCGATT-3'(上游)和5'-C:}TTTGACT-GGGCTGTCCAT-3’(下游);FASL-844T>C;5’-CAAT-GAAAATGAACACATTG-3’(上游)和5’-CCCACTTT;}-GAAATTAGATC-3'(下游)3个位点PCR扩增产物大小分别为122,193,85by.限制性内切酶BstLI.
　　ScrFI和DraIII分别被用来识别3个位点.一1377(等位基因切后片段大小分别为]104by和18hp,一6706等位基因切后片段大小分别为136饰和57bp,一844T等位基因切后片段大小分别为66by和19byPCR反应程序:940C,5min,(940C,30s;650C,30s;72℃,30s)x30次循环,72℃,10min,4℃保存.1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物多态性分析同时有2个人独立进行,样本随即选取,以保证结果准确性3.统计学方法:采用X}拟合优度法检验研究对象的基因型和等位基因的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡.再通过卡方检验比较病例组和对照组基因型、等位基因、统计学变量、抽烟、喝酒以及肿瘤家族史的频数分布.通过无条件逻辑回归计算比值比(OR)值和95%置信区间(CI)来分析基因多态性和膀肤癌的相关性)应用SPSS16.0统计软件分析.
　　结果
　　1.Hardy-Weinberg平衡检验:Hardy-}TUeinberg平衡是指群体内1个位点上的基因型频率在1个随机婚配群体中将代代保持不变,处于遗传平衡状态.对病例组和对照组的基因型频率进行卡方拟合优度检验,结果表明该位点的基因型频率分布没有偏离Hardv-Weiriberg平衡(P>0.05),说明样本来自随机婚配的自然群体2研究人群特征分布:根据研究人群的年龄、性别、吸烟及饮酒情况进行统计分析,结果见表I.病例组和对照组平均年龄分别为(65.3士11.8)岁和(63.1士12.2)岁(P>0.05).病例组男女性别比例分别为:
　　75.3%和24.7%,对照组男女性别比例分别为:80.0%和20.0%(P>0.05).在对样本进行吸烟史和饮酒史进行分类统计时,可见病例组和对照组之间差异有统计学意义,病例组吸烟和饮酒者比例分别为53.4%和52.9%,对照组吸烟和饮酒者比例分别为41.4%和40.5%(P<0.05).
　　3.膀眺癌患者及正常人群中FAS和FASL基因多态性分布:FAS-1377G>A,-670A>G和FASL-844T>C在膀肤癌患者及正常人群中多态性分布及其与膀胧癌的相关性见表2.可见与对照组比较,病例组的FAS-13776>A和F:AS-670A>G基因多态性人群分布差异无统计学意义(P>0.05)二而FASL-844T>C基因多态性的人群分布差异有统计学意义(P<0.05),并且相对于FASL-844(CT+TT),FASL-844CC基因型与膀肤癌明显相关(OR=1.69;95%CI=l.112.57).
　　4.FAS和FASL基因多态性与膀胧癌风险性相关分析:FAS单体型等位基因的分布及其与膀眺癌的相关性见表孔4种可能的FAS单体型等位基因的人群分布在病例组和对照组之间差异有统计学意义(尸<0.05).进一步分析9种单体型基因型,并按照突变位点数分成两组(0一1突变位点组和2一4突变位点组),可见两组分布病例和对照组之间差异有统计学意义(P<0.05卜将0}1突变位点组作为参照,2-4突变位点具有更高的膀胧癌易感性(OR=2.29;95%CI二1.19一4.40)}FAS和FASL基因多态性的联合基因型的分布见表4.按突变位点数分成6组,病例组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)}
　　但是分成两组(1一3突变位点组和4一6突变位点组),病例组和对照组之间差异有统计学意义(P<0.O5),并且相对于1一3个突变位点,携带4一6个突变位点(OR=1.65;95%CI=1.08一2.54)的人群具有更显著的膀肤癌易感性(表5).在>55岁(OR=2.12;95%CI=1.32一3.42)和有吸烟史(OR=2.54;95%CI=I.36}4.73)的人群中,携带4一6个突变位点的个体膀耽癌易感性的趋势更加明显.
　　

　　讨论
　　FAS是人体多种细胞表面的一种膜蛋白,存在于多种细胞的细胞膜及细胞质,是介导细胞凋亡的重要蛋白质分子,FASL是FAS的天然配体,FAS与FASL结合后,向表达FAS的细胞内传递死亡信号,从而引起细胞的凋亡.近年多项研究结果显示,FAS/FASL异常表达,使细胞凋亡能力降低,导致肿瘤细胞逃避宿主免疫系统监视〔12-13.在大多数人类恶性肿瘤中,FAS和FASL表达分别表现为下调和上调一‘4-16,故FAS/FASL系统在肿瘤的发生、发展、转移中扮演重要角色.对于泌尿系肿瘤,己有研究结果证明FAS和FASL的表达在膀胧癌和肾癌的发生和发展中起重要作.研究结果显示,FAS基因变异可引起FAS调控的凋亡降低并诱发膀肤癌.
　　本研究分析了FAS-13776>A、一670A>G和FASL-844T>C基因多态性在湖北省汉族人群中与膀眺癌的相关性二与对照组比较,病例组的FAS-13776>A和FAS-670A>G基因多态性人群分布差异无统计学意义,并且对增加膀眺癌的风险性没有明显影炯但是在分析FAS单体型等位基因时,可见携带2一4个突变位点的个体比携带0一1个突变位点的个体具有一更高的膀胧癌风险性.分析FASL-844T>C位点,可见湖北省汉族人群中,病例组和对照组之间F'_ASL-844T>C多态性分布差异有统计学意义.并且以一844(CT+TT)作为参照,我们发现一844CC基因型具有明显的高膀恍癌风险性.进一步我们分析了3个位点联合基因型,发现联合基因型中携带4}6个突变位点的个体比携带1一3个的具有更高的膀胧癌易感性,并且在老年人和吸烟者人群中该趋势更加明显.
　　本研究结果显示,湖北省汉族人群中FMS和FASL的3个位点的单体型或者联合基因型变异与膀胧癌具有较高的相关性,这表明3个位点的突变可能共同作用于膀胧癌的发生.在老年和吸烟患者中,这3个位点的突变与膀肤癌具有更明显的相关性,说明这类患者更容易暴露于有害因素,并且携带有害突变二但是吸烟是否直接导致诱发膀肤癌的基因突变还需要更多的研究来证明.
　　本研究结果表明,湖北省汉族人群中FAS和FASL基因多态性可能共同与膀肤癌发生相关.这些发现可能对早期的肿瘤预防提供一种有效的方法,并且可能成为临床诊断的肿瘤标志物.对于老年和吸烟的人群,更应重视这些突变位点的存在.
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