转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

 【关键词】  B、,T淋巴细胞衰减子;,基因转染;,T细胞;,增殖

　　Establishment of cell line transfected with human BTLA gene and preliminary study on its biological function

　　WANG Xuefeng, CHEN Yongjing, WANG Qin, YANG Kefang, DAI Qun, WANG Fengming, ZHANG Xueguang*

　　Institute of Medical Biotechnology, Soochow University, Key Laboratory of Stem Cell of Jiangsu Province, Suzhou 215007, China

　　[Abstract]  AIM: To establish 293T cells expressing human BTLA gene, a novel attenuator for B and T lymphocyte. METHODS: The gene encoding human BTLA was amplified by RTPCR from PHA activated T cells, and then the target gene fragment was inserted into retrovirus vector pEGZTerm after being digested with EcoR I and BamH I. The recombinant vector was transfected into 293T cells with LipfectAMINETM 2000, and the cells was further selected with Zeocin. Effect of 293T/BTLA cells on T cells proliferation and activation in vitro was been studied by methods of MTT and cytometry. RESULTS: The stable ex[x]pression of human BTLA on the transfected cell line was identified by flow cytometry analysis. In vitro, 293T/BTLA cells had an inhibitory effect on the proliferation of T cells stimulated by antiCD3 mAb and downregulated the ex[x]pression of activation marker CD25 on the surface of T cells and decreased the secretion of IFNγ and IL10. CONCLUSION: A cell line 293T/BTLA stably expressing the human BTLA protein has been obtained and it can partially inhibit the proliferation and activation of T cells in vitro.

　　[Keywords]B and T lymphocyte; gene transfection; T cell; proliferation

　　[摘 要]  目的: 构建B、 T淋巴细胞衰减子（BTLA）基因转染的细胞作为免疫原, 并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法: 通过RTPCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因, 经EcoR I和BamH I双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZTerm中构建成重组载体pEGZTerm/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞, 并用Zeocin抗生素进行长期筛选; 流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达; 通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果: 流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示, 与未转染的293T细胞相比, 该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体（mAb）刺激的T细胞增殖; 流式细胞术和ELISA法分析揭示, 该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFNγ和IL10 的分泌。结论: 获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。

　　[关键词]B、 T淋巴细胞衰减子; 基因转染; T细胞; 增殖

　　B、 T淋巴细胞衰减子（B and T lymphocyte attenuator, BTLA）是2003年新发现的一个重要的负性共信号分子[1], 属于CD28超家族成员。BTLA表达于外周血成熟的淋巴细胞（包括B细胞、 αβT、 δγT、 CD4+CD25+ T细胞）, 脾脏巨噬细胞和髓系树突状细胞（DCs）, 以及NK细胞呈微弱表达[2]。研究表明, BTLA对T细胞的活化、 增殖起着重要的负调控作用[1-3]。BTLA相应配体为TNFR超家族中的疱疹病毒入侵介质（HVEM）, 其表达于包括T细胞在内的多种免疫细胞表面[5]。HVEM的胞外段有4个富含半胱氨酸的结构域（CRD1, CRD2, CRD3和CRD4）, 其中CRD1可与BTLA结合从而介导负性信号[3]。有趣的是, HVEM同时又可作为LIGHT（homologous to lymphotoxins, inducible, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, ex[x]pression by T lymphocyte）[4]的受体（LIGHT与HVEM的CRD2和CRD3结合[5]）介导正性信号。BTLA/HVEM/LIGHT这种复杂的相互作用可能有助于实现T细胞的精确调控和适度活化, 因此, 探讨BTLA的负性调控作用及其机制具有重要的理论意义。由于该新分子尚缺乏相关的研究材料, 如功能性抗人BTLA的单克隆抗体（mAb）, 对人BTLA的生物学效应与作用机制知之甚少。本研究旨在通过克隆人BTLA编码区全长基因, 并建立能稳定表达人BTLA基因的293T细胞株, 为研制抗人BTLA mAb提供免疫原; 并探讨了其对T细胞增殖与活化的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  293T细胞株购自ATCC公司, 由本所保存。克隆载体pMD18T购自TaKaRa公司。逆转录病毒载体pEGZTerm由德国Sefling教授惠赠。脂质体LipofectAMINETM 2000和Zeocin购自Invitrogen公司。植物血球凝集素（PHA）购自Sigma公司。Taq DNA聚合酶、 Pyrobest高保真DNA聚合酶、 各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶及逆转录试剂盒, 均购自TaKaRa公司。小量质粒抽提试剂盒、 PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒, 均购自杭州维特洁公司。胎牛血清（FCS）购自美国Hyclone公司。TRIZOL RNA抽提液和RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司。鼠抗人CD3激发型mAb购自法国Immunotech公司。人HVEMFc融合蛋白购自ALEXIS公司。激发型抗人CD28 mAb为本所研制。PE鼠抗人CD25 mAb、 FITC抗人CD4 mAb、 FITC抗人CD8 mAb、 PE羊抗鼠IgG及PE羊抗人IgG, 均购自广州晶美公司。人IFNγ和IL10检测试剂盒购自BIOSOURCE公司。

　　1.2  引物设计与合成  根据GenBank中已知BTLA基因的序列, 针对其编码区分别设计用于逆转录扩增的上游引物BTA: 5′ATG AAG ACA TTG CCT GCC ATG CT3′, 下游引物BTB: 5′TTA ACT CCT CAC ACA TAT GGA TGC3′; 以及进一步用于酶切构建重组载体的上游引物BTEcoR I: 5′CTG GAA TTC ACC ATG AAG ACA TTG CCT GCC ATG3′, 下游引物BTBamH I: 5′CTC GGA TCC TTA  ACT CCT CAC ACA TAT GGA TGC3′, 下划线部分分别为EcoR I和BamH I的酶切位点, 引物由上海博亚（英骏）生物技术有限公司合成。

　　1.3  方法

　　1.3.1  人外周血T淋巴细胞的分离与活化  取健康志愿者外周全血（来自苏州红十字血站并经检测合格）, 经Ficoll密度梯度分离获得单个核细胞, 再用绵羊红细胞结合实验纯化获得纯度为95%的T淋巴细胞。

　　1.3.2  人BTLA基因的克隆与鉴定  取1×107的T细胞铺于6孔板中, 加入PHA至终浓度为10 mg/L刺激培养64 h后离心收集T细胞, 以PBS洗3次后, 采用TRIZOL一步法提取总RNA, 按TaKaRa公司的逆转录试剂盒中说明书将mRNA逆转录成cDNA, 取5 μL为模板, 用BTA、 BTB引物进行PCR扩增,  反应条件为94℃变性30 s, 57℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 共35个循环后, 再于72℃延伸10 min。PCR产物经试剂盒纯化后, 在T4 DNA连接酶的作用下与pMD18T载体连接, 并转化感受态细菌Top10。用含氨苄青霉素平板筛选阳性菌落, 扩增后抽提质粒, 经PCR和EcoR I、 BamH I双酶切鉴定后, 送上海博亚（英骏）公司测序验证。

　　1.3.3  重组逆转录病毒载体的构建  以测序正确的pMD18T/BTLA质粒为模板, 以引物BTEcoR I和BTBamH I用Pyrobest高保真酶同上述条件进行PCR扩增, 经纯化后用EcoR I和BamH I进行双酶切, 同时双酶切pEGZTerm, 回收目的片段进行连接并转化感受态细菌Top10, 按上述方法鉴定获得重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA。

　　1.3.4  稳定表达人BTLA的293T细胞株的构建  参照文献[6], 将重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA用脂质体法转染预铺于6孔板中的293T细胞, 48 h后, 以500 mg/L浓度的Zeocin抗生素进行筛选, 将获得的293T/BTLA阳性克隆亚克隆后扩大培养。同时制备转空载体pEGZTerm的阴性对照293T/mock细胞。收集293T/BTLA和293T/mock细胞, 用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达。进一步利用HVEMFc融合蛋白与293T/BTLA结合, 以PE羊抗人IgG为二抗用流式细胞信检测BTLA蛋白在细胞膜上的表达。

　　1.3.5  淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的检测  参照文献[7], 将T细胞以1×105个/孔加入到预先用抗人CD3激发型mAb（02 mg/L, 0.4 mg/L）以及联合或不联合抗人CD28激发型mAb（05 mg/L）包被的96孔板中。同时加入经丝裂霉素（50 mg/L）预处理的293T/BTLA或293T/mock细胞,  2×104个/孔, 每组设3个复孔。于37℃、 50 mL/L CO2培养3 d后用MTT比色法测定T细胞的增殖。另外, 用04 mg/L抗人CD3激发型mAb包板, 将T细胞（1×106个/孔）与293T/BTLA或293T/mock细胞（2×105个/孔）加于24孔板中共培养。3 d后, 用流式细胞术测定T细胞表面活化标记CD25的表达, 并采用ELISA试剂盒测定IFNγ和IL10的分泌。

　　2  结果

　　2.1  人BTLA编码区全长基因的克隆、 重组逆转录病毒载体的构建及其鉴定  通过RTPCR法, 从经PHA活化的人T淋巴细胞中扩增出大、 小不同的两个基因片段（图1A）。测序结果表明, 870 bp的大片段为BTLA编码区全长基因, 而726 bp的小片段为缺失第3个外显子的BTLA基因的一种剪接体（结果未显示）。构建的重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA经EcoR I和BamH I双酶切后, 能够释放出870 bp的目的基因片段（图1B）, DNA测序进一步证明插入载体中的基因片段与BTLA基因的序列完全一致。

　　2.2  稳定表达人BTLA基因的293T细胞的制备及鉴定  用Zeocin抗生素加压获得的转染BTLA基因的293T细胞, 用激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测pEGZTerm载体中所带GFP报告基因的表达。结果显示, GFP高表达于mock细胞和BTLA基因转染的293T细胞上（图2、 图3）。将融合蛋白HVEMFc与转染的293T细胞共孵育后, 以PE羊抗人IgG为二抗, 用流式细胞术检测转染细胞上BTLA的表达。结果表明, 人BTLA基因已成功转入293T细胞中并能稳定高表达（图4）。

　　图1  人BTLA基因的克隆及重组逆转录病毒载体的酶切鉴定（略）

　　Fig 1  Cloning of human BTLA gene and restriction enzyme digestion analysis of recombinant retrovirus vector

　　A. M: DL2000 DNA marker; 1: RTPCR product of human BTLA gene(fulllength being 870 bp, splice variant being 726 bp, aspecific band approximately being 250 bp). B. M: DL2000 DNA marker; 1: Loop locked supercoil pEGZTerm/BTLA (9527bp); 2: Digested product of pEGZTerm/BTLA/EcoR I+BamH I(human BTLA gene fulllength being 870 bp, linear pEGZTerm being 8757 bp).

　　图2  BTLA基因转染的293T细胞中GFP表达的激光共聚焦显微镜观察（略）

　　Fig 2  Observation of GFP ex[x]pression in 293T cells transfected with BTLA gene under laser confocal microscope (×400)

　　A: 293T/mock cells;  B: 293T/BTLA cells.

　　图3  GFP在293T/BTLA细胞中表达的流式细胞术检测（略）

　　Fig 3  Detection of GFP ex[x]pression in 293T/BTLA cells by FCM

　　A: 293T/mock cells; B: 293T/BTLA cells.

　　图4  BTLA基因转染的293T细胞中BTLA表达的流式细胞术检测（略）

　　Fig 4  Detection of BTLA ex[x]pression in 293T/BTLA cells by FCM

　　A: 293T/mock cells binding to HVEMFc; B: 293T/BTLA cells binding to HVEMFc.

　　2.3  293T/BTLA细胞对T细胞的抑制作用  以293T/BTLA细胞或293T/mock细胞（对照）为效应细胞, 以纯化的T细胞为靶细胞, 与04 mg/L鼠抗人CD3激发型mAb或04 mg/L抗CD3 mAb+05 mg/L抗CD28 mAb共培养3 d后, 分别检测T细胞增殖和T细胞表面CD25的表达以及IFNγ和IL10的分泌。结果表明, 与对照组相比, 293T/BTLA细胞对经激发型抗CD28 mAb和抗CD3 mAb活化的T细胞的体外增殖具有一定的抑制效应(P<005, 图5）, 并能一定程度地下调活化的CD4+、 CD8+T细胞上CD25的表达（图6）, IFNγ与IL10的分泌也有所降低（图7）。

　　图5  293T/BTLA基因转染细胞对T细胞体外增殖抑制作用（略）

　　Fig 5  Inhibitory effect of 293T/BTLA on proliferation of T cells

　　图6  293T/BTLA细胞对T细胞CD25表达的影响（略）

　　Fig 6  Influence of 293T/BTLA cells on CD25 ex[x]pression on T cells

　　图7  293T/BTLA细胞抑制T细胞分泌细胞因子的ELISA检测（略）

　　Fig 7  Detection of inhibiting cytokine secretion by 293T/BTLA cells by ELISA

　　A: 0.4 mg/L antiCD3 mAb; B: 0.4 mg/L antiCD3 mAb+0.5 mg/L antiCD28 mAb.

　　3  讨论

　　BTLA不仅低表达于静止T细胞, 而且T细胞活化后呈上调性表达[2]。研究表明, BTLA与其配体HVEM作用可诱导其胞浆段酪氨酸磷酸化, 进一步募集含蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1, SHP2的Src同源结构域,从而传递抑制信号[1, 8]。本研究用PHA刺激人外周血T细胞活化后, 以RTPCR克隆了人BTLA全长基因。将其插入带有GFP报告基因的逆转录病毒载体中, 并转染293T细胞, 用Zeocin抗生素长期筛选后, 通过激光共聚焦显微镜观测GFP的表达, 用流式细胞术检测细胞膜上BTLA蛋白进行验证, 结果表明, 成功地建立了可稳定高表达人BTLA基因的转染细胞, 提供了为研制抗人BTLA的mAb免疫原。将BTLA基因转染的293T细胞与T细胞混合, 加入抗CD28 mAb和激发型抗人CD3 mAb激活T细胞后, 发现BTLA基因转染的293T细胞可抑制T细胞增殖,下调CD25的表达及IFNγ与IL10的分泌。因此, 该基因转染细胞对T细胞在体外的增殖与活化具有一定的负性调节作用。近期研究表明: 共信号受体/配体分子间的信号普遍存在双向传递现象[9, 10], 即受体与配体间可相互传递信号, 引发生物学效应。故推测, 293T/BTLA细胞对T细胞的抑制效应一方面会不会存在这样一种可能: 通过BTLA与HVEM的相互作用, 由HVEM向T细胞内传递抑制性信号？也可能是, 活化的T细胞表达的HVEM能上调另一配体LIGHT的表达, 通过HVEM/LIGHT介导的正性信号进一步促进T细胞增殖与细胞因子分泌[4]。虽然研究已表明, 在蛋白水平上BTLA和LIGHT能同时与HVEM结合[11], 但由于BTLA基因转染的293T细胞上的BTLA与T细胞上的HVEM结合后, 可能由于在细胞之间的空间位阻限制了LIGHT与HVEM的结合, 从而降低了HVEM/LIGHT信号途径对T细胞增殖的促进作用, 尚待于进一步研究。

　　参考文献:

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　　基金项目: 国家自然科学基金重点项目（30330540）; 苏州大学青年教师研究基金（Q3120536）; 苏州大学博士论文立项资助（23320514）

　　（苏州大学医学生物技术研究所 江苏省干细胞重点实验室, 江苏 苏州 215007）

 

 

作者：王雪峰, 陈永井, 王勤, 杨科芳, 代群, 王凤鸣, 张学光