抑制角膜新生血管生长的研究进展

【摘要】  角膜新生血管（CNV）多见于感染、炎症、外伤或角膜手术后。CNV是眼表疾病的显著特征之一，血管化的角膜不但严重影响视力，而且是角膜移植失败的主要原因。近年来，随着对CNV的深入研究，在血管的形成机制和治疗方面取得了一些成果，主要就CNV治疗的新进展作一综述。

【关键词】  角膜 角膜新生血管 治疗

    0引言

     透明、无血管是角膜的重要特征。在感染、外伤、免疫反应等病理情况下,毛细血管由角膜缘向角膜内生长，形成角膜新生血管（corneal neovascularization ,CNV）。虽然新生血管对感染清除、伤口愈合、抑制角膜溶解等有一定作用，但CNV可破坏角膜正常微环境，使眼前节相关免疫赦免偏离消失，不但严重影响视力，而且能够显著增加角膜移植片排斥反应的危险性。在发达国家，新生血管化引起的眼部疾病已占失明原因的首位。在我国，仅眼外伤所致的CNV就约占整个角膜疾病的10%，它所引起的失明已成为目前所面临的突出的问题之一。

    1 CNV的发生机制

     CNV的发生是一个极其复杂的病理过程，其确切机制目前仍不完全清楚,相关研究证明，CNV的发生主要与下列因素有关：(1)角膜水肿；(2)促血管生成因子增加；(3)抑制血管生成因子减少；(4)炎症反应；(5)缺氧；(6)角膜神经损伤。近年来，随着免疫学和分子生物学的飞速发展，许多因素如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质金属蛋白酶（MMP）、一氧化氮合酶-Ⅱ（NOS-Ⅱ）等在CNV形成中的作用已经受到了人们的关注，并已取得一些研究成果。

    2 CNV的治疗进展

    2.1药物治疗  长期以来，人们一直致力于研究CNV的发病机制以及能阻止CNV形成的抑制剂，许多新的抗血管生成的药物被相继发现并进入动物实验和临床试验阶段。

    2.1.1血管内皮细胞生长因子抑制剂  血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前发现的重要的血管生长因子，通过阻断或抑制VEGF的作用，可有效的防止或减少新生血管的产生。(1) PKC（丝/苏氨酸蛋白激酶C）412 和 PKT787： Ozaki等[1]和Seo等[2]研究发现PKC412 能阻止VEGF受体的磷酸化,可完全抑制实验鼠视网膜新生血管；进一步研究发现PKT787能完全抑制氧诱导的缺血性视网膜病变的鼠模型的视网膜新生血管,明显抑制激光诱导的鼠CNV模型中的新生血管,部分抑制发育中的视网膜血管的形成,由此提示VEGF信号通道在CNV 的致病过程中起关键作用。(2) 脉丝平(maspin)：maspin为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中独特的一员,这种分泌蛋白由Ⅱ型肿瘤抑制基因编码,是血管生成的有效抑制物质。体外实验发现, maspin可以使内皮细胞向bFGF和VEGF的移行停止；可以限制细胞的有丝分裂和管状结构的形成。体内实验表明, maspin可有效阻止CNV生成，其衍生物同样具有抑制血管生成的作用[3]。(3) 卡特消（cartcell）：卡特消是新近发明的一种口服用抗血管生成制品，其主要成分为鲨鱼软骨萃取液，它能有效阻止VEGF和其在人体内皮细胞上的受体结合，从而抑制血管生长因子的活性；对于MMP-2，MMP-9，MMP-12等各种酶的活性也有较强的抑制作用，可以诱发内皮细胞自然凋亡，提高血管生长抑制素的浓度，因而抑制新生血管的生长[4]。

    2.1.2基质金属蛋白酶抑制剂  基质金属蛋白酶（MMPs）是一族Zn2+依赖性内源性蛋白水解酶，以水解细胞外基质为主要功能。其中主要是明胶酶A(MMP-2，9等)降解血管基底膜和细胞外基质蛋白的作用。近年来对基质金属蛋白酶活性表达的干扰成为治疗新生血管的新靶点。(1)卡托普利 (captopril)  卡托普利通过自由巯基与血管紧张素转化酶活性中心Zn2+结合而抑制血管紧张素转化酶活性,从而成为临床用来治疗高血压的常用药；同样它也可以与基质金属蛋白酶活性中心的Zn2+结合而抑制其活性。研究发现它能特异性地直接作用于毛细血管内皮细胞,抑制内皮细胞的迁移。唐维强等[5]采用卡托普利灌喂和球结膜下注射两种用药方式观察其对CNV生长的影响,结果发现新生血管的生长面积在两种用药方式中均较对照组明显减小,球结膜下注射较灌喂给药的抑制作用更为明显,且这两组间新生血管的生长面积也存在统计学差异。(2)强力霉素（doxycycline）  研究显示，四环素类抗生素独立于抗菌活性之外，具有抑制MMPs降解细胞外基质的功效。它有较强的Zn2+，Ca2+结合能力，与MMPs酶活性中心的金属离子结合形成螯合物，消除了MMPs的催化活性位点，进而阻止了MMPs降解胶原等细胞外基质[6]。强力霉素的副作用与毒性在四环素类中低，但结合锌离子的能力却强。梁丹等[7]按照30mg/（kg·d）灌胃给药的方法，观察强力霉素对大鼠化学伤CNV形成的影响，结果发现强力霉素抑制CNV作用明显，各时间点CNV的抑制率随时间推移呈上升趋势。

    2.1.3内皮抑素和血管抑素  内皮抑素（endostatin, ES）是近年来发现的一种由胶原蛋白XVⅢ降解产生的内源性新生血管形成抑制因子。ES可以特异地抑制血管内皮细胞的生长,还可通过诱导抗凋亡蛋白bcl2，bclXL 及促凋亡蛋白bax的失衡影响内皮细胞的生存[8]，而对其他细胞没有抑制作用,具有无毒、不引起免疫反应和无耐药性产生的优点，被认为是目前极具潜力的新生血管形成抑制因子之一。冯怡等[9]用MMT方法检验重组内皮抑素对血管内皮细胞的增殖抑制活性；使用重组人内皮抑素滴眼液,治疗小鼠角膜碱烧伤导致的CNV形成。结果表明，新生血管长度及血管化面积均较对照组明显减少，ES能够有效抑制碱烧伤诱导的CNV形成而对角膜组织愈合没有明显影响。血管抑素（angiostatin，AS）是目前发现的强有力的新生血管生成抑制剂之一。AS由纤溶酶原片断的头4个Kringles组成。重组的纤溶酶kringlel-3(rpk1-3) 能够抑制bFGF 或VEGF 诱导的CNV, 并且作用成剂量依赖性。Moser等[10]研究发现, AS是通过与细胞表面ATP酶的α/β亚单位结合来下调内皮细胞的增殖和迁移,从而发挥抗新生血管生成的作用。Shin等[11]在兔角膜中置入angiogenin(血管生成素)诱导CNV形成,观察AS对新生血管的作用,结果表明AS有明显抑制CNV的作用,而且角膜中白细胞浸润明显减少。

    2.1.4色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)  PEDF初从视网膜色素上皮细胞分离得到，是一种高效的内生性新生血管抑制剂和神经营养因子。PEDF对新生血管的形成有明显的抑制作用，去除了PEDF的角膜基质提取物,其抗新生血管活性可以被完全消除。通过对不同方法建立的CNV模型动物进行玻璃体腔内、视网膜下腔以及球旁注射表达PEDF的腺病毒载体进行研究,结果均表明PEDF可以明显抑制CNV的形成, 甚至使已形成的CNV发生回退[12,13]。

    2.1.5 1,25二羟维生素D3  1,25二羟维生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3)不仅参与骨和钙的调节，而且还在免疫调节中扮演重要角色。能选择性地抑制T细胞、B细胞的增殖和细胞因子生成；调节抗原提呈细胞职能，早期抑制树突状细胞的分化和成熟及诱导其对抗原的耐受。Suzuki等[14]用缝线法诱导小鼠CNV，发现1，25二羟维生素D3可抑制Langerhans细胞的移行,并且一定浓度的1,25二羟维生素D3对体外培养的人角膜上皮细胞产生的IL-1α、IL-1β、IL-8等前炎症因子都有明显的抑制作用。1,25二羟维生素D3可能是通过抑制细胞因子的产生来抑制Langerhans细胞的移行和CNV的形成。

    2.1.6氨氯吡脒  氨氯吡脒是一种选择性抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的利尿剂,它通过抑制钠离子通道选择性抑制u-PA对底物的催化活性,而不影响组织型纤维蛋白溶酶原激活物、纤维蛋白酶及凝血酶的活性。杨新怀等[15]给予实验组兔每日腹膜下注射氨氯吡脒30mg,5d后发现实验组CNV较对照组减少69.32%(P<0.01),提示氨氯吡脒可显著抑制bFGF诱导的CNV。

    2.1.7高压氧疗  缺氧是刺激VEGFmRNA表达的强因素，相反,高浓度氧可降低VEGFmRNA及蛋白的表达水平。高浓度氧对新生血管形成的抑制可能正是通过下调VEGF蛋白的水平来实现的。Edelman等[16]将角膜化学烧伤后的鼠放在有机玻璃箱内,灌注70%氧和平衡氮气。结果高浓度氧治疗抑制了40%VEGF蛋白表达,显著地降低了CNV的密度。

    2.2基因治疗  由于角膜的特殊解剖结构、组织的透明性、细胞的单纯性以及相对独立和易于观察等特点, 角膜作为基因治疗的靶器官具有得天独厚的优势。目前，许多新的基因治疗方法在角膜疾病的治疗中进行了探索性实验研究。Lai等[17]将大鼠角膜化学烧伤后,前房内注入携带VEGF受体2sFlt21基因的腺病毒载体抑制CNV的形成，结果显示转基因组较对照组角膜的新生血管明显减少。近，柳林等[18]以复制缺陷型重组腺病毒为载体研究血管内皮细胞生长抑制因子VEGI151对CNV的作用。VEGI151重组腺病毒在病变细胞内能成功表达相对分子质量为17 300的蛋白,通过体外实验发现,它可以强烈抑制静脉内皮细胞的生长；体内实验表明,结膜下注射携带VEGI151基因的腺病毒后，CNV的面积较对照组明显减少，具有显著抑制炎症性CNV形成的作用，这一方法为CNV的基因治疗提供了新的思路。

    2.3外科治疗  CNV的外科治疗即采用不同的方法封闭血管，包括光动力疗法（PDT）、氩激光、电凝、及眼表重建手术抑制CNV。

    2.3.1光动力疗法 光动力疗法（PDT）是通过光敏剂进入体内受到适当波长光的激发产生一系列光化学毒效应，导致不可逆的组织损伤和细胞死亡的一种治疗方法。PDT突出的靶细胞选择性、副作用小的特性,使其自1913年应用以来在眼科领域的研究和应用中发展迅速。主要表现在以下方面：⑴治疗新生血管疾病 ；⑵治疗恶性肿瘤；⑶抑制白内障术后后囊混浊；⑷抑制青光眼术后滤过区瘢痕化。黄映湘[19]采用国产光敏剂血琳单醚行PDT治疗兔CNV，病理结果显示PDT治疗后3h，激光区可见大量炎症细胞浸润，但行PDT后lwk炎症反应即消失，并可见到新生血管的封闭和狭窄，狭窄的新生血管管腔内有纤维样物质，角膜内皮细胞及周围组织未见损伤。Spaide等[20]在玻璃体内注射4mg曲安萘德(triamcinolone acetonide，TA)后,迅速行PDT治疗AMD引起的脉络膜新生血管，结果表明,联合治疗比单用PDT所需再治疗的次数减少,血管封闭的时间延长,且疗效安全可靠[21-24]。目前，PDT的治疗剂量、强度以及降低术后复发等方面仍在进一步研究中。

    2.3.2手术治疗  根据CNV的部位和程度、角膜缘干细胞缺失的程度和角膜损伤的严重程度，可选择以下眼表重建手术抑制CNV：角膜缘移植、角膜缘移植联合板层或穿透性角膜移植、羊膜移植、羊膜移植和角膜缘上皮移植联合穿透性角膜移植等[25]。近年来羊膜移植成为眼表重建术的研究热点。羊膜具有丰富的Ⅳ型胶原纤维,是支持上皮生发细胞生长的理想物质。在某种意义上讲，羊膜移植就是角膜上皮细胞的基底膜移植，基底膜微环境的改善有利于上皮的移行,加强其与基底的粘附,促进上皮的分化。李线等[26]采用新鲜羊膜移植术观察其对角膜碱烧伤后CNV和上皮愈合作用的影响,并与保存羊膜作比较，结果显示,羊膜移植具有明显抑制CNV和促进上皮愈合作用,它能使眼表快速上皮化和维持眼表的稳定。新鲜羊膜上皮细胞能够分泌更多的蛋白酶抑制剂,可减轻角膜炎症反应及减少新生血管的生长,同时分泌更多的促进细胞增殖、生长的细胞因子,从而在角膜碱烧伤的早期治疗中发挥更佳的治疗效果。关于角膜碱烧伤后羊膜移植的手术时机问题,尚存在争议。谢立信等[27]认为:伤后时间愈短手术效果愈好,在碱烧伤早期,碱性液体在角膜渗入不深,羊膜本身吸附部分碱液,阻止了碱性液体的继续损害,另外羊膜自身的生物学效应可以阻止角膜碱烧伤的病理演变过程。目前，羊膜移植及其联合术已成为手术治疗CNV及眼表重建的有效方法。

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26李线,丁琦,陈剑,黄菊天,徐锦堂.新鲜羊膜移植术对角膜新生血管抑制作用的实验研究.眼科新进展,2001;21(6):407-409

27谢立信,史伟云,刘艳霞,李绍伟.羊膜移植治疗早期重症眼部烧伤.眼外伤职业眼病杂志,2000;22:483-485

 

作者：李慧，高晓唯，任 兵